噬菌体的特性及其在动物生产中的应用

陈朴然 符 翔 郭志强 吕景智*

(1.西南大学动物科学技术学院,重庆 400715;2.四川省畜牧科学研究院,动物遗传育种四川重点实验室,成都 610066)

抗生素在动物养殖生产实践中有生效快、抗菌范围广、效果明显等特点,但随着抗生素的使用剂量增大,细菌的耐药性以及药物在动物机体的残留引起了人们的广泛关注。细菌对抗生素的耐药性现象并不少见,已经发展出耐药性机制,以对抗来自占据相同环境生态位(生态位指物种在生态系统中的位置和作用,用以描述物种在非生物和生物环境中占有的地位)的其他的自然产生的抗生素[1]。世界卫生组织认为细菌的耐药性是严重威胁人类健康的因素之一。随着2020年7月1日我国农业农村部禁抗令的正式实施,养殖业迫切需要找到新的药物,以一定程度上替代抗生素在动物生产中的作用。

噬菌体是一种纯天然的抗细菌的病毒,内在毒性较小,能够自我复制,与宿主细菌的识别与结合具有高度的专一性且能够与宿主一起进化,能有效地解决对抗生素有耐药性细菌引起再次感染的问题[2-3]。噬菌体具有多种优势,如宿主特异性、无需多次给药、宿主存在时的自我复制、无不良副作用、对环境友好等[4]。在人类和动物健康领域,噬菌体疗法在东欧地区已经实施了60多年[5]。尽管噬菌体是在抗生素出现之前发现的,但由于缺乏研究和应用,噬菌体的杀菌效果仍然不及抗生素,以致于多年来抗生素仍然占据灭菌的主导位置[6]。近些年,由于不断发展的细菌对抗生素耐药性问题,科学家对噬菌体方面的研究重新产生了兴趣[7-9]。

美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲食品安全局(EFSA)已批准在农业食品部门使用噬菌体鸡尾酒疗法(噬菌体鸡尾酒疗法是指3种或3种以上的噬菌体联合应用来杀灭细菌的一种治疗方法)[10]。本文主要介绍了噬菌体的结构、分类、裂解的作用机理,噬菌体在动物机体内的转运等特性,以及噬菌体在家禽、家畜和水产动物中的应用,以期为噬菌体在动物生产中的扩大应用范围提供参考。

1 噬菌体概述

噬菌体是地球上最丰富的生物实体之一,在地球上有1031～1032个噬菌体,在生态系统中无处不在。这些细菌病毒具有DNA或RNA形式的遗传物质,由蛋白质外壳包裹[11]。噬菌体的长度变化很大,通常在24～200 nm。T4噬菌体是最大的噬菌体之一,其长度约为200 nm,宽度为80～100 nm;典型噬菌体基本特征包括1个头部、1个衣壳和1个尾部[12](图1)。此外具有20面体形状或具有20个侧面和细丝形状的噬菌体也很常见。

图1 噬菌体经典结构示意图(左)以及其尾部区域通过穿透细胞壁将DNA插入宿主细菌细胞的示意图(右)

1.1 噬菌体的分类

噬菌体分类复杂种类繁多,目前发现约6 000多种噬菌体,其中包括6 196种细菌噬菌体和88种古细菌噬菌体[13]。分类方法也较多,此处介绍常见的有2种分类方法。

第1种,根据噬菌体作用效果的不同,可分为2种:1)噬菌体处于裂解周期。感染宿主细菌后的噬菌体能将宿主菌裂解,并释放大量新的噬菌体被称为裂解性噬菌体。2)噬菌体处于溶原周期。噬菌体入侵宿主菌后,宿主菌没有裂解死亡,噬菌体的遗传物质以噬菌体原的方式存在于宿主中的噬菌体被称为溶原性噬菌体。

第2种,是国际病毒分类委员会发布,一共分为5个阶段:1)第1阶段,按照核酸类型(DNA/RNA)及其单双链形式被划分为5个群(群Ⅰ、群Ⅱ、群Ⅲ、群Ⅳ);2)第2阶段,在每个群下面,再按照科间的亲缘关系设立“目”,科间亲缘关系较远的或者成员较少的直接设立科;3)第3阶段,按照属间的亲缘关系设立科;4)第4阶段,科下设立属;5)第5阶段,属下设立种,再按照需求设立亚种[14]。噬菌体分类以群Ⅰ双股DNA病毒之尾病毒目肌尾病毒科为例,详见表1。

表1 噬菌体分类示例表

1.2 噬菌体的裂解与作用机理

裂解性噬菌体和溶原性噬菌体在宿主内的裂解过程如图2所示。溶原性噬菌体入侵宿主菌后,遗传物质会以噬菌体原的形式存在,无法裂解宿主菌[15],所以引起宿主裂解的通常是裂解性噬菌体。

图2 噬菌体的裂解循环过程(左)和溶原循环过程(右)

裂解性噬菌体的作用机理一般分为5个阶段,包括吸附、注入、复制、组装和释放[16]。

吸附阶段:当噬菌体特定的尾部吸附结构(如尾丝、尾刺)识别到宿主细胞表面特定的受体时,会与之发生特异性结合,随后感染开始。注入阶段:一般只有噬菌体核酸遗传物质进入宿主,外壳不进入。复制阶段:噬菌体核酸进入宿主细胞后,以自身核酸为模板,利用宿主细胞原有的酶等其他物质,开始表达早期蛋白质。组装阶段:噬菌体组装可以自发地或借助特定的酶进行。释放阶段:子代噬菌体在宿主内组装完成后,在内溶素等裂解酶的作用下从内部裂解宿主细胞壁,破坏宿主,放出大量的噬菌体[17]。噬菌体的作用机理如图3所示。

图3 噬菌体的作用机理

1.3 噬菌体在动物机体内的转运过程

噬菌体在动物机体的转运过程包括噬菌体的吸收、分布、代谢和排泄。吸收是噬菌体进入血液的过程。分布是噬菌体从血液输送到身体组织。一旦到达目标组织,就会被代谢并转化为活性形式,最后一步是从体内排出。噬菌体在体内的转运过程如图4所示。

1.4 噬菌体的优缺点

噬菌体具有许多优点:1)噬菌体具有高度特异性,仅识别特定的细菌,因此对天然微生物群无不利影响,不会导致菌群失调;2)噬菌体在地球上的含量十分丰富,获取方便,价格低廉;3)噬菌体在不同的环境条件下都能储存,稳定性相对较高;4)噬菌体是自我复制的,不需要重复给药如果细菌对噬菌体产生耐药性,那么噬菌体确实会自然进化感染上述耐药细菌,从而将细菌逃逸的机会降至最低,这是噬菌体相对于抗生素的一个优势[20]。

图4 噬菌体在小鼠体内的转运过程

噬菌体也有以下缺点:1)有限的宿主范围,无法起到广谱的抗菌作用;2)有抗性突变体发生的风险以及毒力因子转导的可能性;3)噬菌体需要宿主才能不断生长和复制,如果没有它们所特有的细菌病原体,它们将只能维持一段时间的活性。

2 噬菌体在动物生产中的应用

2.1 噬菌体在家禽生产中的应用

在传统饲养体系中,鸡的种群密度很高,在一个农场可以达到数十万只,这增加了疾病快速传播的风险,并伴随着经济损失。然而,同样高的种群密度也有利于噬菌体在群体中的传播,降低治疗大量动物的成本。大肠杆菌、沙门氏菌在大规模的禽类养殖中是最常见的致病菌,感染大肠杆菌,可导致鸡的肺泡炎、心包炎、肝周炎,是该行业发病率和死亡率的重要原因。Huff等[21]使用PT(噬菌体疗法)治疗试验性大肠杆菌感染气囊的鸡;在第1项研究中,当在大肠杆菌攻毒的同一天,使用了含有2种不同噬菌体混合制剂的气溶胶喷雾,结果表明噬菌体能将鸡的死亡率减半,当试验鸡在噬菌体处理后被大肠杆菌攻毒3 d时,气溶胶喷雾中更高浓度的噬菌体能够显著降低死亡率;在第2项研究中,建立将鸡进行感染然后治疗的模型,结果表明,经噬菌体治疗的死亡率降低到7%,而未经治疗的鸡死亡率约为48%[22]。

致病性大肠杆菌可在家禽养殖中显著提高发病率和死亡率。Barrow等[23]的一项研究使用噬菌体预防鸡的大肠杆菌败血症,未经噬菌体治疗的鸡的死亡率几乎为100%,即使将噬菌体治疗推迟到临床症状出现之前,仍然可以大大降低感染的严重程度。Xie等[24]的一项研究调查了噬菌体对雏鸡腹泻的影响,将噬菌体治疗与抗生素治疗(氯霉素0.1 mg/g体重)对大肠杆菌菌株感染的鸡存活率的影响进行比较,研究发现,噬菌体疗法可将鸡的腹泻发病率降低至26%,而对照组为51.6%;噬菌体处理组的存活率大约是对照组的10倍,是抗生素治疗组的6倍;值得注意的是,噬菌体处理组的体重高于抗生素治疗组。Toro等[25]也进行了类似的试验,结果表明,先感染鼠伤寒沙门菌,然后用噬菌体处理的鸡的平均体重高于未经处理的鸡。

在家禽的噬菌体处理中沙门氏菌已成为目标,这种病原体是人类急性细菌性肠炎的主要原因。在2004年,欧盟报告了18万多例沙门氏菌病。受污染的家禽和鸡蛋被广泛认为是沙门氏菌的主要来源。此外,沙门氏菌的一些血清型可导致鸡的发病和死亡,并在农场环境中长期存活。Berchieri等[26]使用从人类污水中分离出的噬菌体处理鸡,与未经噬菌体处理的鸡相比,可减少试验性鼠伤寒沙门菌在鸡肠道的定植数量,并显著降低死亡率。Fiorentin等[27]使用从放养鸡中分离的噬菌体来减少肉鸡的肠炎沙门氏菌PT4的定植,用肠炎沙门氏菌攻击1日龄肉鸡,7 d后用1011PFU的3种噬菌体混合物处理,噬菌体感染5 d后,与对照组相比,记录到盲肠肠炎沙门氏菌携带量减少(从4.86×109PFU到1.682×1010PFU);噬菌体治疗后,PT组沙门氏菌定植的明显减少持续了25 d。Atterbury等[28]研究证明,通过口服高浓度(1011PFU)噬菌体悬浮液,肉鸡体内肠炎链球菌和肠炎沙门氏菌的盲肠定植数量减少。Borie等[29]记录到,噬菌体处理后肉鸡肠道肠炎链球菌携带量显著减少;与Huff等[21]的结果一样,这项研究通过气溶胶输送噬菌体,显著降低了鸡肠炎沙门氏菌感染的发生(裂解噬菌体组感染率为72.7%,对照组为100%)。

家禽中噬菌体处理的另一种重要的人畜共患病的病原体是弯曲杆菌,家禽是人类食物链中弯曲杆菌的重要宿主。世界卫生组织认为弯曲杆菌是腹泻病的主要病因。自2005年以来,欧洲食品安全局已宣布弯曲杆菌病是最常见的食源性疾病之一,每年超过200 000例,占欧盟人类人畜共患疾病的70%。弯曲杆菌很容易在鸡肠内定植,并已从大部分新鲜家禽产品中检测到[30-32]。一项风险分析表明,将尸体弯曲菌污染减少约2个数量级的干预措施可能导致人类弯曲菌病相应减少[33]。

Atterbury等[34]研究发现,当存在噬菌体时,自然定植肉鸡盲肠内的弯曲杆菌数量通常较低。Wagenaar等[35]报道了用噬菌体治疗鸡弯曲杆菌的情况,并研究了预防性和治疗性噬菌体应用的效果。该研究包括为期10 d的噬菌体治疗试验,预防组在噬菌体治疗的第4天感染空肠弯曲菌,而治疗组在空肠弯曲菌感染的第6天进行噬菌体治疗;2组的空肠弯曲菌数量至少减少了约2个数量级,在1周内下降到比未治疗组低约10倍,所以噬菌体治疗是减少肉仔鸡空肠弯曲菌定植的一种有效的方法。

Loc Carrillo等[36]研究证明,与对照组相比,对感染空肠弯曲菌的肉鸡进行噬菌体处理后,5 d内盲肠内标记菌株浓度减少。细菌载量的减少取决于噬菌体载量、噬菌体弯曲菌群和给药后时间。Carvalho等[37]比较了口服灌胃和噬菌体鸡尾酒添加到饲料中的区别;与给药后4 d的口服途径相比,通过喂食途径给药的噬菌体导致弯曲杆菌粪便计数的降低更明显;结果表明,通过使用噬菌体鸡尾酒,可以成功减少家禽中2种最常见的弯曲杆菌菌株数量。所以通过添加噬菌体到饲料中能更好地减少弯曲杆菌数量。与口服灌胃相比,这是一种在农场应用噬菌体疗法的简单且更实用的方法。

2.2 噬菌体在家畜生产中的应用

Smith等[38]在对小鼠进行早期试验后,使用噬菌体鸡尾酒治疗小牛、小猪和羔羊的肠炎;用产肠毒素大肠杆菌菌株O9∶K30.99进行攻毒;用2种不同噬菌体的高滴度(1011PFU)混合物处理的9头初乳喂养的小牛中没有一头患病(对照组为93%);在腹泻开始时,用噬菌体治疗的13头缺乏初乳的小牛中,有2头死亡(对照组为100%);这项研究表明,即使在出现临床症状时使用噬菌体,也可以大大降低发病率和死亡率。用于挑战仔猪和羔羊的肠毒素大肠杆菌菌株也取得了类似的成功。Callaway等[39]使用噬菌体混合物显著减少绵羊肠道中大肠杆菌O157∶H7的数量。在Barrow等[23]的一项研究中,一种特异性附着在大肠杆菌K1荚膜抗原上的溶性噬菌体,被用于治疗肠道致病性大肠杆菌攻击的初乳缺失犊牛,噬菌体治疗动物的菌血症被延迟,寿命延长。在Sheng等[40]的一项研究中,噬菌体治疗无法减少大肠杆菌O157定植绵羊的数量;然而,通过在直肠-肛门连接处使用高滴度(1010PFU)的噬菌体和在饮用水中应用低滴度(106PFU)的噬菌体,荷斯坦牛直肠中的O157数量显著减少。Matthews等[41]认为约5%牛的肠道中携带大量的大肠杆菌O157,对人类健康构成较大风险。虽然Sheng等[40]的研究没有证明大肠杆菌O157在荷斯坦牛肠道中完全消除,但使用噬菌体治疗减少这种病原体在反刍动物中携带和流行,降低人类接触这种病原体的风险,也可以产生可观的公共效益。

2.3 噬菌体在水产养殖中的应用

水产养殖业的重大损失主要是由于细菌和病毒引起的传染病造成的[42]。其中,弧菌病、气单胞菌病、爱德华氏菌病、分枝杆菌病、出血性败血症、溃疡病和柱状体病等细菌性疾病十分普遍,需要严格的卫生管理,否则会造成巨大的经济损失。2010年至2017年期间,泰国主要海鲜市场之一的Mahachai市场的产品因卫生管理疏忽造成贸易量减少,带来的经济损失估计为73.8亿美元,此外还有42亿美元的出口损失[43]。一些常见的细菌感染包括鳍腐病、溃疡病、鳃病会导致严重并发症[44]。美国食品和药物管理局和欧洲食品安全局已批准在农业食品部门使用噬菌体(鸡尾酒疗法)。

给药时间是一个非常重要的因素。当治疗因感染而延迟时,死亡率通常显著增加,最好的选择是在感染前预防性服用噬菌体,并持续服用[45-46]。Jun等[47]通过在浸泡中预防性使用噬菌体,白虾的存活率提高了75%,而在饲料中预防性使用噬菌体,白虾的存活率提高了50%。与此类似,Schulz等[48-49]的研究结果表明,与感染后24 h治疗组相比,在感染前1天服用噬菌体能将欧洲鳗鱼存活率和虹鳟鱼的存活率分别提高16%和6%。

Karunasagar等[50]研究发现,与使用抗生素相比,使用噬菌体治疗的虾存活率提高了20%,表明噬菌体疗法是虾孵化场使用抗生素的有效替代方法。与此类似,Vinod等[51]在虾哈维氏弧菌感染后,与抗生素处理组相比,噬菌体处理组虾的存活率提高了46%,这表明噬菌体疗法在降低死亡率上的效果可能比使用抗生素更有效。

3 不足与展望

由于噬菌体可以特异性裂解某些细菌,因而在抗菌方面具有较为广泛的应用前景,所以必须要更全面地了解噬菌体在动物生产中作为添加剂以及药物的综合影响,应研究噬菌体在体内的作用机理,以及增殖代谢方式。噬菌体在动物生产中需要关注的重心应该集中在以下几个方面:1)噬菌体在动物生产中的安全性。禁抗令实施后迫切需要有效的替代物,因为噬菌体本身是一种病毒,所以需要保证在动物体内的安全性,避免噬菌体带来的其他副作用,进而影响生产效益。2)噬菌体在动物生产中的稳定性:动物体内环境、pH以及温度等都会影响噬菌体的作用效果,噬菌体在溶液中的裂解效果比在固态中好,所以要保证在不同的动物体内,要有一个稳定的效果。3)噬菌体在动物生产中的多样性。一方面,因为噬菌体在起作用前需要先识别,噬菌体很难像抗生素那样起到广谱杀菌作用,因而噬菌体具有高度的特异性,可以针对不同的细菌种类培养不同的噬菌体,所以噬菌体的添加种类可以多样或者噬菌体的混合制剂。另一方面,噬菌体的添加形式也可以是多样的,例如在饮水中添加,或者作为饲料添加剂、噬菌体喷雾等多种形式来进行添加。4)噬菌体在作为添加剂处理动物时的最佳浓度的问题。感染的多样性指被吸附或感染的易感宿主与噬菌体的比率。了解MOI(是感染时病毒与细胞数量的比值)的阈值对于优化疗效至关重要。例如,较低的MOI可能比较高的MOI效果好,因为病毒粒子可能通过聚集而失活。此外,MOI取决于宿主与噬菌体相互作用,并随培养基、噬菌体和宿主而变化[52-53]。

4 小 结

噬菌体发现较早,且能特异性裂解某类细菌,未来的研究应该更多地将关注放在噬菌体减少细菌感染以及肠道有害细菌等方面。研究对象可选取细菌感染较为突出的水产动物,以及肠道健康对动物生产影响较大的动物,例如鸡、猪、兔、牛等。另一个关注点应该放在噬菌体的添加方式以及噬菌体的最适MOI上。综上所述,在饲料端“禁抗”的大背景下,鉴于噬菌体的特性,值得吸引更多科研工作者的研究和关注。