免疫组织化学染色检测肺结核组织中的Ag85B

方诗宇,段绍琪,陈雪倩,于江,孙杰,刘凤君

(川北医学附属医院感染科,四川 南充 637000)

结核病是对人类威胁最大的传染病之一,由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染所致。世界卫生组织《2021年全球结核病报告》[1]指出,2020年估计有990万新发结核病例,虽然很多国家加强了防控,但结核病的疫情仍呈反弹的趋势,约300万结核病患者未及时得到诊断和治疗。由于结核病可以治愈,因此早期诊断、及时治疗对于终止结核病的传播非常关键。

肺结核是结核病中最常见的类型,其诊断方法主要有影像学、免疫学、病原学、病理学等[2],根据中华人民共和国卫生行业标准—《肺结核诊断》(WS288-2017)[3],以病原学和病理学作为确诊依据,其中病原学包括细菌学(抗酸菌涂片镜检、结核分枝杆菌培养)及分子生物学。但敏感性不能满足临床需要。特异性抗原也是病原微生物感染的诊断依据之一,2017年《中国结核病病理学诊断专家共识》[4]指出,采用免疫组织化学染色(immunohistochemical staining,IHC)的方法检测结核病变组织中MTB特异性抗原的表达对结核病的诊断有帮助。

Ag85B是MTB的主要分泌抗原之一,其表达量高[5],目前已有研究发现利用IHC可以检测到肺结核、淋巴结及肾结核组织中Ag85B的表达。但有关研究较少,且由于目前尚无可应用于临床诊断的免疫组化特异性抗体及统一的判读标准,需要开展更多的临床转化及评估研究。因此,本研究通过免疫组织化学染色检测石蜡包埋肺组织标本中Ag85B的表达情况,并与抗酸染色比较,了解其对于肺结核的诊断意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年5月至2021年8月于川北医学院附属医院手术切除的19例经病理诊断为肺结核且已行抗酸染色的石蜡包埋肺组织标本为研究对象。纳入标准:符合2017年《中国结核病病理学诊断专家共识》[4]I类或Ⅱ类诊断标准,且术后抗结核治疗有效。以非肺结核肺组织(肺癌切除标本正常组织断端)20例为阴性对照。

1.2 方法

1.2.1 试剂 Ag85B兔多克隆抗体(bs-9268R)购于北京博奥森古生物技术有限公司。柠檬酸组织抗原修复液(100×)购于北京博奥森古生物技术有限公司。即用型免疫组化SP试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司。DAB显色试剂盒(20×)购于福州迈新生物技术有限公司。

1.2.2 HE染色 石蜡切片经脱蜡后置于梯度酒精中各3 min,然后蒸馏水洗 1min;苏木素染色5～10 min后流水洗1 min,置于1%盐酸-乙醇中3 s,水洗2 s;1%氨水返蓝5～10 s,流水洗2 min,蒸馏水水洗2 min;0.5%伊红染色1～3 min,蒸馏水水洗2 s;梯度酒精脱水各3 min;最后置于二甲苯(I、II、III)中各5 min,吹干后中性树胶封片。

1.2.3 免疫组织化学染色 采用SP法。一抗为Ag85B兔多克隆抗体,稀释比例1:300;二抗为生物素标记的羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物。病理切片首先进行HE染色,由病理医生复检核实存在结核病灶。所有切片均行脱蜡、抗原修复,操作步骤按免疫组化试剂盒说明书进行,DAB染色室温孵育5 min,苏木素染色30 s,1%盐酸-乙醇分化2 s,蒸馏水水洗,梯度酒精脱水,吹干后中性树胶封片。每批染色使用PBS溶液代替一抗设置阴性对照。阳性结果:IHC染色阳性结果为棕色颗粒,着色部位中心颜色较深,周围较浅。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0 软件进行数据处理和分析。计数资料以[n(%)]表示,组间比较以Fisher精确概率法分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺结核组织中Ag85B的表达特点

选取的19例肺结核标本均已由本院病理科行抗酸染色。选择抗酸染色(+++)的标本进行Ag85B的免疫组化染色,并通过与HE及抗酸染色对比以了解抗原阳性信号的分布特点。如图所示:肺结核组织切片经HE染色可见慢性肉芽肿改变,伴凝固型坏死;抗酸染色后可见大量红色杆状、细长略弯曲的抗酸杆菌,主要分布在干酪样坏死区及周围与肉芽肿交界处;Ag85B的免疫组化染色阳性信号为棕色颗粒物,主要沉积在坏死灶及其周围,与抗酸染色比较可见Ag85B蛋白的分布与抗酸杆菌相关,范围更广。而阴性对照的免疫组化染色未见阳性信号或仅可见少许棕色信号,染色较肺结核组浅,且分布无特殊规律。见图1。

2.2 免疫组化检测Ag85B及抗酸染色的结果

19例肺结核组织标本中Ag85B免疫组化阳性16例,阴性3例,敏感度为84.21%;抗酸染色阳性10例,阴性9例,敏感度为52.63%。20例正常肺组织标本中,Ag85B检测阳性3例,阴性17例,其特异度为85.00%;抗酸染色检测阳性0例,阴性20例,特异度为100.00%。免疫组化的阳性和阴性预测值分别为84.21%、85.00%;抗酸染色的阳性及阴性预测值分别为100.00%、68.97%。见表1。

表1 免疫组化检测Ag85B蛋白及抗酸染色的结果

2.3 免疫组化染色与抗酸染色检测结果对比

19例肺结核标本中,10例抗酸染色阳性,9例抗酸染色阴性,抗酸染色敏感度为52.63%(10/19)。Ag85B蛋白的免疫组织化学染色结果如下:10例抗酸染色阳性的标本中,Ag85B的免疫组化染色全部阳性;9例抗酸阴性的标本中,6例免疫组化呈阳性,因此Ag85B的敏感度为84.21%(16/19)。与抗酸染色相比,免疫组化敏感性提高31.58%,差别有统计学意义(P=0.039)。采用同样的统计学方法,依次对两种检测手段的特异度、阳性预测值及阴性预测值进行对比,二者差异均无统计学意义(P=0.115,P=0.265,P=0.173)。

3 讨论

病理学检查是结核病的重要诊断手段之一,结核典型的大体标本呈灰黄色的干酪样坏死,而镜下典型的病变是肉芽肿伴干酪样坏死,外周有纤维结缔组织和慢性炎症细胞浸润,病变周边可见朗格汉斯巨细胞[6]。需要注意的是,结核病的大体观察、组织学表现及细胞学表现虽然具有一定的特异性,但所有上述表现亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中[3],且仍有14%的结核病未出现坏死性病变[7]。所以常规的病理学特点结合病原学依据对于确诊结核的价值更大。在坏死性肉芽肿基础上行抗酸染色经济、简便,是目前临床寻找MTB最常用的方法,但抗酸染色敏感性较低[8-9],目前不能满足临床需要,且需使用高倍镜及油镜,寻找抗酸杆菌费时费力。近年来,分子病理学检测技术发展迅速,虽敏感性较抗酸染色有所提高,但可能因气溶胶污染容易出现假阳性结果[10],对实验室及操作人员有较高的要求,在结核病负担较重的发展中国家难以广泛开展。

随着对结核病免疫机制的深入研究,一些结核分支杆菌抗原为结核诊断提供了新思路。近年来,研究发现采用IHC的方法可以检测出在结核病变组织切片中MTB特异性抗原的表达,对结核病的诊断有参考价值。目前的研究主要针对MPT64、ESAT-6、Ag85B等MTB分泌性抗原,但相关研究均较少,更重要的是由于目前尚无可应用于临床诊断的特异性抗体及统一的判读标准,专业人员呼吁开展更多的临床转化及评估研究。本实验采用免疫组化法检测肺结核组织中的Ag85B蛋白,发现抗原阳性信号沉积在结核坏死灶及其周围,分布与抗酸杆菌有关,范围更广,符合Ag85B作为分泌性抗原不仅存在细胞内,也分泌到细胞周围的特点。与车南颖等[11]、Wang等[12]的研究结果相似,以上结果提示免疫组化检测Ag85B可用于结核的诊断。

本研究发现在抗酸染色阳性的10例标本中,Ag85B免疫组化均为阳性,在抗酸染色阴性的9例标本中仍有6例为阳性,其敏感度为84.21%,远远高于抗酸染色的52.63%。20例正常肺组织标本中,Ag85B检测阳性3例,特异度为85.00%。前期研究[13-16]报道Ag85B的敏感性为39.3%～64.4%,而特异性均为100%。敏感性和特异性的差异可能与组织来源的不同有关,也可能与IHC结果判读标准不完全一致有关。本研究中阴性对照的阳性信号弱且分布无规律,如果提高阳性信号的强度并把分布规律纳入阳性判定标准,特异性即为100%,但敏感性可能会降低。因此,该方法的临床应用嗜需临床医生、病理专家等相关专业人士统一判定标准。虽然不同研究的结果有差异,但大部分实验结果提示免疫组化的敏感性高于抗酸染色,且免疫组织化学阳性信号易于观察,可以有效提高工作效率。因此Ag85B的免疫组化在结核诊断中具有潜在的应用价值,与其他抗原联合检测意义更大。