阿利新蓝和改良Hale胶体铁黏多糖染色法在玻尿酸栓塞病理诊断中的应用

董怡铭,杨琛腾,赵国婷,张丽华,左 敏,王松军,马如飞,刘 霞,张国忠,2

玻尿酸又称透明质酸、糖醛酸,是一种广泛分布于人体各处的糖胺聚糖,由重复的二糖D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成[1]。目前,玻尿酸和胶原蛋白作为化妆品填充物在整形和重建手术中的应用越来越广泛,因过量和(或)使用不当而引起的并发症时有发生,其中脑内和肺内小动脉阻塞导致脑梗死和肺栓塞是严重的并发症类型,常导致严重残疾甚至死亡[2-5]。在血管腔内检测到玻尿酸成分,对于该类死亡案例的病理学诊断具有重要意义。本文采用阿利新蓝和改良Hale胶体铁黏多糖染色法对玻尿酸进行染色,染色效果较好,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源选取河北医科大学司法鉴定中心阴道壁注射玻尿酸引起死亡的1例肺组织标本蜡块,同一组织块5 μm厚连续切片后置于普通载玻片上。标本使用在尸检时已告知,经死者家属知情同意。

1.2 仪器设备Leica RM2135石蜡切片机;Leica HI1210展片仪;Olympus光学显微镜;尼康全自动显微照相系统。

1.3 主要试剂HE染色试剂盒(G1120)、阿利新蓝染色试剂盒(G1560)、改良Hale胶体铁黏多糖染色试剂盒(G4600)均购自北京索莱宝公司。

1.4 染色方法切片60 ℃烤片40 min,常规脱蜡入水。HE染色:自来水浸泡1 min;苏木精染液染色15 s,自来水洗去浮色;1%盐酸乙醇分化1 s,自来水冲洗 3 min;伊红染液染色5 s,自来水洗去浮色;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。阿利新蓝染色:Alcian酸化液浸泡3 min;Alcian染色液染色30 min,流水冲洗;核固红染色液复染5 min,流水冲洗1 min;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。改良Hale胶体铁黏多糖染色:弱酸溶液浸泡5 min进行预处理;浸入新配Hale染色工作液染色50 min;弱酸溶液冲洗3次,每次2 min;新制Perls染色工作液滴染10 min,蒸馏水洗3次;Perls复染液滴染5 min,水洗;梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。

结果判读:利用光镜观察切片上的HE染色、阿利新蓝染色和改良Hale胶体铁黏多糖染色,当阿利新蓝染色和改良Hale胶体铁黏多糖染色在组织中呈蓝色时为阳性。

2 结果

HE染色显示大量不规则的嗜碱性无定形晶体物质沉积(图1)。阿利新蓝染色显示无定形晶体物质为蓝色(图2)。改良Hale胶体铁黏多糖染色显示无定形晶体物质为蓝色(图3)。

①②③图1 常规HE染色:显示不规则的无定形晶体物质沉积,呈嗜碱性 图2 无定性晶体物质阿利新蓝染色阳性,呈蓝色 图3 无定性晶体物质改良Hale胶体铁黏多糖染色阳性,呈蓝色

3 讨论

玻尿酸是由D-葡萄糖醛酸分子和由β-(1-4)和β-(1-3)糖苷连接的N-乙酰葡萄糖胺分子构成的重复单元组成的生物聚合物。它属于一类叫黏多糖的物质,属于糖胺聚糖家族[6]。玻尿酸可作为治疗关节炎、干眼症、皮肤溃疡等具有确定药理作用的产品,也可作为辅助眼科手术产品、外科手术防粘连产品、填充增加组织容积等产品,被广泛应用于医疗领域和微整形领域。当注射玻尿酸操作不当时,玻尿酸会直接注射到血管中,或因注射过快产生压力过大导致渗入血液循环。在血液中形成栓子,经吻合支随血液运行至眼动脉、肺动脉或脑动脉,导致眼球萎缩、肺栓塞、脑梗死等严重并发症,甚至死亡。HE染色虽然能够很好地观察组织的形态结构,但不能特异地显示组织中的酸性物质。阿利新蓝染色和改良Hale胶体铁黏多糖染色可显示组织中异常沉积的酸性黏多糖。通过HE染色结合阿利新蓝染色和改良Hale胶体铁黏多糖染色法观察并发现血管中的玻尿酸成分,是诊断注射玻尿酸操作不当致严重并发症或死亡案例的重要指标。

阿利新蓝又称爱先蓝、阿尔辛蓝,是一种类铜钛花青共轭染料。这种阳离子染料的异硫脲基通过静电与组织内的多聚阴离子相连。如含羧基和硫酸根的酸性黏液物质的羧基和硫酸根形成不溶性复合物,即染料分子中带正电荷的盐键和酸性黏液物质中带负电荷的酸性基团结合呈蓝色。胶体铁粒子在酸性条件下也可以和酸性黏液质紧密结合形成不溶性复合物,利用普鲁士蓝反应使酸性黏多糖呈现蓝色,改良Hale胶体铁黏多糖染色法较阿利新蓝染色法着色更深且不易被洗脱。应用阿利新蓝染色法时,阿利新蓝染液的pH值对实验结果具有重要影响,当pH值为2.5时,组织内的羧基电离,带有一个负电荷,与阿利新蓝中的阳离子形成盐键,对带有羧基的组织(如透明质酸、上皮酸性黏蛋白)染色;当pH值为1.0时,组织内的硫酸根电离,带有一个负电荷,与阿利新蓝中的阳离子形成盐键,使带有硫酸根的组织(如硫酸黏液物质)染色。核固红染色液是组织切片染色中常用的复染液,染色后细胞核呈红色。染色液可重复使用多次,但染色效果会逐渐降低。应用改良Hale胶体铁黏多糖染色法时,改良Hale染色液染色时间需要严格控制在40～60 min;且改良Hale染色液染色需要在酸性条件下进行,存放时间较长的试剂盒应用3%乙酸进行切片预处理。由于含铁血黄素也会和Perls染液反应形成蓝色沉淀,建议设置阴性对照以排除干扰。

首先对组织切片进行HE染色,观察到血管腔内不规则的无定形晶体物质沉积,然后通过阿利新蓝染色和(或)改良Hale胶体铁黏多糖染色法确定无定形晶体物质成分。HE染色结合阿利新蓝和(或)改良Hale胶体铁黏多糖染色法能准确地检测玻尿酸成分,且染色步骤简便、易行,对病理诊断具有重要意义,因此在检测玻尿酸中具有实用价值。