亚低温治疗对猪心脏骤停体外心肺复苏后免疫功能及神经功能的影响

王晋祥，续国武，王太兰，王乐，靳衡，柴艳芬△

心脏骤停（cardiac arrest，CA）是患者死亡的重要原因之一。最新研究显示，我国每年因CA死亡人数高达103 万例，而院外心脏骤停（out of hospital cardiac arrest,OHCA）出院存活率及神经功能良好的比例仅为1.3%和1%［1］。体外心肺复苏（ECPR）与传统心肺复苏（CPR）相比有着更高的成功率，如能在CA 后30 min 内实施ECPR，患者存活率可提高至40%［2］。 目标体温管理（target temperature management，TTM）已被证实是改善CA 患者生存率及神经功能预后的重要干预措施［3］。目前关于亚低温治疗（MHT）对ECPR后神经功能影响的基础性研究较少，而对免疫功能是否存在抑制作用尚存在诸多争议。本研究通过探讨MHT 对猪心脏骤停体外心肺复苏后免疫功能及神经功能的影响，旨在为CA患者ECPR后的MHT提供相关理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 实验动物与分组 健康实验巴马香猪18只，由天津中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK（津）2020-0005，体质量35～45 kg。实验前禁食24 h，不禁水。采用随机数字表法将其分为假手术（Sham）组、常温治疗（NT）组和MHT组，每组6只。NT组和MHT组经右心室诱颤建立CA模型，随后采取ECPR与体温管理；Sham组仅进行常规麻醉、气管插管与CA模型置管。

1.1.2 实验设备 实验ECMO 系统，包括：滚压式血泵、WEL-1000Wplus 热交换水箱（天津汇康公司）；膜式氧合器、配套管路及15 F 股动脉插管、17 F 股静脉插管（德国Maquet公司）；心电监护仪、大动物呼吸麻醉一体机、纤维支气管镜、除颤仪、心肺复苏机、手术床、吊塔吊灯、控温毯（迈瑞医疗）；便携式超声仪（Philips）；高频电刀及电凝设备（北京索吉瑞）；外科手术器械。

1.2 方法

1.2.1 麻醉及术前准备 实验猪称体质量后给予戊巴比妥钠30 mg/kg肌内注射，诱导麻醉成功后丙泊酚4～6 mg/（kg·h）持续泵入维持麻醉。经纤维支气管镜辅助下气管插管，呼吸机辅助机械通气（潮气量10 mL/kg，频率15次/min，吸入氧浓度40%）；同时辅以1%～3%异氟烷持续吸入麻醉。床旁超声引导下一侧股动脉置入4 F动脉测压导管进行脉搏指数连续心输出量监测（PICCO）实时监测有创血压及血温变化。乳酸钠林格、5%葡萄糖氯化钠注射液10～15 mL/（kg·h）交替持续静脉补液。

1.2.2 体外膜肺氧合（ECMO）安装与预充 ECMO管路采用无菌生理盐水预充。预充完毕后调整为待机状态。ECMO导管置入：床旁超声引导下行股动静脉穿刺置管，动脉插管置管深度10～15 cm，静脉插管置管深度30～45 cm（以导管尖端达右心房为准）。确认插管位置后用管道钳夹闭，静脉注射1 mg/kg肝素钠预抗凝，妥善缝合固定。

1.2.3 建立CA模型 床旁超声引导下经颈内静脉将双极起搏电极送入右心室，当电极置入深度18～22 cm 时，心电监护仪提示出现室性期前收缩或室性心动过速，提示电极位置抵达右心室心内膜。开始予以电流刺激（9 V直流电），持续3～5 s，参照评估标准［4］（出现室颤心律，收缩压下降至25 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa）确认成功诱导室颤致CA 后停止机械通气，观察5～10 min，期间不予任何干预，随后启动ECPR抢救流程。

1.2.4 实施ECPR 持续胸外按压，频率120 次/min，按压深度3～4 cm；立即恢复机械通气（吸入氧浓度100%，余参数同前）；实施非同步直流电击除颤（双向200 J），间断给予肾上腺素、胺碘酮直至心搏恢复，重新建立循环。同时将股动脉、股静脉插管分别连接预充好的ECMO 管路，ECMO 流量调整为20～40 mL/（kg·min），氧流量调整为1.0～1.5 mL/min。维持平均动脉压＞65 mmHg，整个过程持续补液并监测电解质及酸碱平衡。

1.2.5 TTM 各组动物均处在恒定室温25 ℃下进行；MHT组通过ECMO 变温水箱将目标温度保持32～36 ℃；NT 组通过ECMO 变温水箱将目标温度保持37 ℃；Sham 组采用控温毯将目标体温保持37 ℃；MHT 组治疗24 h 后通过变温水箱以0.5 ℃/h 速度复温2～10 h，然后对各组进行神经功能缺损（NDS）评分，最后按伦理规定处死动物。

1.2.6 标本收集与指标检测 采集各组动物静脉血10 mL，3 000 r/min 离心15 min，分别取血清和血浆待检。采用放射免疫分析法测定IgM、IgA、IgG含量。采用流式细胞仪测定T细胞亚群CD4、CD8、CD4/CD8水平。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定神经元特异性烯醇化酶（NSE）和S100B 蛋白表达水平。试剂盒购自北京沃莱士生物科技有限公司，标本储存和实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 使用SPSS 20.0 进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法。计数资料比较采用例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组实验前基础参数对比 各组动物实验前体质量、中心体温、血流动力学参数（心率和平均动脉压）、呼吸频率比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。其中NT 组和MHT 组均成功经右心室诱颤制作CA 模型，并全部成功实施ECPR，复苏成功率100%。

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各组实验前基础参数比较（n=6，）

Tab.1 Comparison of basic parameters before experiment between the three groups表1 各组实验前基础参数比较（n=6，）

均P＞0.05。

?

2.2 各组神经功能评价指标比较 与Sham 组相比，NT 组与MHT 组NDS 评分升高，NSE 和S100B 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与NT 组相比，MHT 组NDS 评分降低，NSE 和S100B 蛋白表达水平下降（P＜0.05），见表2。

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各组神经功能评价指标比较（n=6，）

Tab.2 Comparison of nerve function indexes between the three groups表2 各组神经功能评价指标比较（n=6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与NT组比较，P＜0.05。

?

2.3 各组免疫功能指标对比 Sham 组、NT 组和MHT 组IgM、IgA、IgG 及T 细胞亚群CD4、CD8、CD4/CD8水平差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各组免疫功能评价指标比较 （n=6，）

Tab.3 Comparison of immune function indexes between the three groups表3 各组免疫功能评价指标比较 （n=6，）

均P＞0.05。

?

3 讨论

3.1 TTM 可使心肺复苏后患者获得更好的神经功能预后 CA是全球重大公共卫生问题，并随着新型冠状病毒肺炎大流行愈发突出［5］。2020年国际复苏联络委员会对全球16 个OHCA 中心的数据分析显示，接受复苏的患者30 d 存活率为3.1%～20.4%，仅2.8%～18.2%有良好的神经功能预后［6］。有文献报道，我国北京、上海等城市的OHCA患者出院时神经功能良好的患者比例更低［7］。因此提高心肺复苏成功率和改善复苏后神经功能成为CA 患者预后的关键因素。Bartos 等［8］发现ECPR 患者死亡或神经功能不良的风险显著降低，而且启动越早获益越大。2021 年欧洲复苏委员会（ERC）指南推荐对于CA 出现自主循环恢复（ROSC）但未恢复意识的患者，应尽快将目标体温控制在32～34 ℃［9］，且MHT 持续时间至少24 h，复温速度应由TTM 设备进行控制（0.25～0.50 ℃/h），可获得更好的长期神经功能［10］。

3.2 MHT 可改善CA 复苏后神经功能 CA 复苏后脑损伤是由神经系统突发缺血和复苏后再灌注引起，这些损伤可能在CA 初期、复苏过程中和复苏后依次发生，而TTM 对脑损伤有明确的神经保护作用［11］。目前国内外学者将NSE和S100B蛋白作为评价CA 患者复苏后脑损伤的特异性标志物［12］。本研究发现与Sham 组相比，NT 组与MHT 组NSE 和S100B蛋白表达水平显著升高，表明动物CA复苏后脑部出现显著缺血再灌注损伤；MHT 组与NT 组相比NSE 和S100B蛋白表达水平下降，表明MHT 可显著减轻CA 复苏后脑损伤。Cui 等［13］证实TTM 可显著改善CA 猪的神经功能，其可能机制为MHT 可抑制大脑小胶质细胞的激活与极化，减轻小胶质细胞合成及分泌炎性因子，发挥神经保护作用。本课题组前期研究发现MHT 可有效降低猪CA 经ECPR 后炎性因子的表达水平［14］。本研究同时对比各组NDS评分，结果显示MHT 组与NT 组评分显著高于Sham组，而MHT组NDS评分显著低于NT组，进一步表明MHT可减轻CA后脑损伤，并显著改善CA复苏后的神经功能。需要指出的是，本研究采用的神经功能指标只能评估神经功能的部分水平，并不能反映全部神经功能的状态，因此全面评估MHT 对CA 复苏后神经功能的影响仍需更加深入的研究。

3.3 MHT对CA复苏后免疫功能无显著影响 目前关于MHT对CA复苏后免疫功能影响的研究尚不明确。陈富明等［15］研究发现MHT 可改善心肺复苏成功患者的肺功能，且对免疫功能无影响。本研究中，各组IgM、IgA、IgG及T细胞亚群CD4、CD8、CD4/CD8水平无明显差异，这一结果与陈富明等发现相一致，表明早期给予一定时间MHT及正确复温处理对CA经ECPR 后免疫功能无明显影响。值得提出的是，CD4 和CD8 并不能反映全部免疫功能状态，因此不同温度、不同时间窗及治疗时长可能对机体免疫功能产生不同的影响，这一领域仍需继续深入研究。

综上所述，MHT可改善猪心脏骤停体外心肺复苏后神经功能，降低脑损伤标志物NSE 和S100B 蛋白表达，且对免疫功能无显著影响，本研究可为临床MHT提供一定的理论依据。