新疆伊犁昭苏不同动物源粪肠球菌耐药性及耐药基因检测

徐琦琦， 陈月月， 李宏博， 陈万昭， 秦蕾， 王东， 夏利宁*

（1.新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052； 2.霍城县职业技术学校，新疆 伊犁 835200）

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为革兰氏阳性球菌，是肠球菌属的一种，广泛分布于各种环境介质中，如空气、土壤、水源等，同时也是人和动物胃肠道内正常菌群之一[1]。过去，人们认为肠球菌危害不大，某些肠球菌甚至可以作为益生菌来使用。但近年来不断有调查表明，肠球菌已经成为医院感染的重要病原体，且高毒力的肠球菌往往来自粪肠球菌[2]。粪肠球菌感染可引起牛子宫蓄脓[3]、绵羊脑炎[4]、肉鸡内脏病变[5]等。李鹏[6]研究表明，粪肠球菌的耐药水平可以作为在具体环境下所释放该抗菌药物耐药性选择压力的参考，可将粪肠球菌用作当地细菌耐药性的指示菌，并以此研究为基础来反映当地其他种菌株的耐药现状。前人研究多以集约化养殖场样本为主，很少针对散养动物样本进行深入探讨。因此，本研究通过采集新疆伊犁昭苏地区散养户不同动物源样品，对从中分离的粪肠球菌进行耐药性和相关耐药基因的检测，了解该地区不同动物源粪肠球菌的耐药现状及耐药基因携带情况，为当地畜牧养殖的合理用药提供科学依据，同时填补当地粪肠球菌的耐药数据库，及时掌握当地流行的耐药基因类型，为防控耐药性及耐药基因的扩散提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

于2020 年11 月从新疆伊犁昭苏县各散养户分别采集牛、羊的鼻拭子（200 份、210 份）和肛拭子（200 份、210 份）及鸡的泄殖腔拭子（300 份）样品共1 120份，从中分离试验用粪肠球菌。

1.2 试剂

肉汤（mueller-hinton borth，MH）培养基、脑心浸液（brain-heart infusion broth，BHI）培养基、肠球菌购自青岛海博生物技术有限公司；科玛嘉显色培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司（原产地法国科玛嘉）；1×TE 缓冲液、50×TAE 购自上海生工生物有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL 2000 DNA Maker 购自北京天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分离与鉴定 用灭菌棉签分别从牛、羊的鼻腔、直肠和鸡的泄殖腔内捻转采集内容物样品后放入装有灭菌肉汤的采样管中。在实验室无菌间吸取含有样品的灭菌肉汤放入装有高盐BHI 的圆底离心管中，42 ℃ 180 r·min-1培养18～24 h 后，在肠球菌选择性培养基上划线，37 ℃倒置培养18～24 h，挑取平板表面光滑、突起、周围有黑色沉淀的白色或半透明单一菌落，置于装有BHI 的圆底离心管中，42 ℃过夜培养后在科玛嘉显色培养基上划线，37 ℃倒置培养16～20 h 后挑取蓝绿色单菌落于装有BHI 的圆底离心管中，42 ℃过夜培养，完成对肠球菌的初次筛选。参照刘洋[7]方法合成粪肠球菌持家基因引物，进行PCR 扩增，将检出有目的条带的菌液送至上海生工生物有限公司进行测序。通过BLAST 进行序列比对，同源性＞96.0%的菌株判定为粪肠球菌。

1.3.2 保菌 在装有1 mL 菌液的EP 管中加入0.5 mL 60.0%（体积分数）灭菌甘油，使之成为20.0%（体积分数）的甘油菌，保存至-20 ℃冰箱。

1.3.3 药物敏感性试验 按照美国临床和实验室标准协会（Clincal and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的琼脂稀释法[8]执行标准对粪肠球菌进行8 大类10 种抗菌药物的药敏试验，所选抗菌药物分别为四环素类（四环素、多西环素）、氟喹诺酮类（环丙沙星、左氧氟沙星）、噁唑烷酮类（利奈唑胺）、糖肽类（万古霉素）、β-内酰胺类（氨苄西林）、酰胺醇类（氟苯尼考）、氨基糖苷类（庆大霉素）、大环内酯类（红霉素）。粪肠球菌ATCC29212 作为标准质控菌株，药敏试验结果以敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）、耐药（resistance，R）表示。

1.3.4 耐药基因检测 根据选择的抗菌药物选择相对应的耐药基因进行检测。包括抗大环内酯类药物基因ermA、ermB、ermC；抗噁唑烷酮类药物基因cfr、optrA、poxtA；抗酰胺醇类药物基因fexA；抗四环素类药物基因tet(M)；抗氟喹诺酮类药物基因emeA；抗氨基糖苷类药物基因aph(3’)-Ⅲ。参考文献[9-17]合成上述基因的引物序列并进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后，送至上海生工生物工程有限公司测序，测序结果经BLAST比对后确定。

1.3.5 数据分析 使用SPSS22.0 软件进行数据分析，单因素分析采用卡方检验或Fisher 精确检验。

2 结果与分析

2.1 粪肠球菌分离鉴定结果

采集不同动物源各部位样品共1 120 份，经粪肠球菌持家基因鉴定得到263 株粪肠球菌，分离率为23.5%。鸡源粪肠球菌、羊鼻粪肠球菌、羊肛粪肠球菌、牛鼻粪肠球菌和牛肛粪肠球菌的分离率分别为21.3%、19.0%、28.6%、21.0%和28.5%（表1）。

表1 不同动物源粪肠球菌的分离结果Table 1 Isolation results of Enterococcus faecalis from different animal sources

2.2 粪肠球菌药敏结果

对不同动物源粪肠球菌的耐药性进行分析，结果（表2）表明，羊源粪肠球菌对红霉素、四环素、氟苯尼考、多西环素的耐药率分别为78.0%、83.0%、83.0%、84.0%，均高于75.0%，显著高于鸡源、牛源粪肠球菌；鸡源粪肠球菌对红霉素、四环素和多西环素的耐药率分别为36.0%、48.4%和50.0%，显著高于牛源粪肠球菌。在羊源粪肠球菌中，羊鼻拭子粪肠球菌对利奈唑胺的耐药率为42.5%，显著高于羊肛拭子、鸡源、牛鼻拭子和牛肛拭子粪肠球菌。5 种来源粪肠球菌对庆大霉素的耐药率均较低。羊源粪肠球菌对环丙沙星表现为完全敏感；鸡源和牛源粪肠球菌对环丙沙星耐药情况表现为差异不显著。左氧氟沙星耐药菌株仅在鸡源粪肠球菌中检出。所有粪肠球菌分离株均对氨苄西林和万古霉素表现为完全敏感。

表2 不同动物源粪肠球菌的耐药率Table 2 Resistance of E. faecalis from different animal sources

2.3 粪肠球菌的多药耐药结果

表3 为伊犁昭苏不同动物源粪肠球菌多药耐药结果。263 株粪肠球菌中4 耐占比最高，为26.2%。64 株鸡源粪肠球菌中，0 耐占比最高，为45.3%；5 耐次之，为18.8%。100 株羊源粪肠球菌中，4 耐占比最高，为64.0%；99 株牛源粪肠球菌中，仅检测到对1～3 种药具有耐受性，其中1 耐占比最高，为24.2%。

表3 不同动物源粪肠球菌的耐药率Table 3 multidrug resistance of Enterococcus faecalis from different animal sources（%）

2.4 粪肠球菌中耐药基因的检测

263株粪肠球菌中除cfr、ermC和poxtA基因未检出外，其他7种耐药基因均有检出（表4）。外排泵基因emeA在不同来源粪肠球菌中均有检出，检出率高于80.0%。在羊源粪肠球菌中，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ基因的检出率分别为73.0%、75.0%、75.0%、81.0%和77.0%，显著高于鸡源和牛源粪肠球菌。ermA基因仅在鸡源和羊源粪肠球菌中检出，且羊源粪肠球菌检出率显著高于鸡源粪肠球菌。

表4 伊犁昭苏不同动物源粪肠球菌耐药基因检测结果Table 4 Detection results of drug resistance genes of Enterococcus faecalis from different animal sources in Zhaosu， Yili

3 讨论

本研究在不同种类动物的鼻腔、肛门和泄殖腔中分离鉴定出的粪肠球菌对被检抗菌药物表现不同程度的耐药，其耐药程度由高到低依次为羊源、鸡源和牛源；羊源、牛源的鼻拭子与肛拭子粪肠球菌之间的耐药性无明显差异。羊源的鼻拭子、肛拭子对红霉素、四环素、多西环素和氟苯尼考的耐药率均在70.0%以上，高于阿迪莱·卡哈曼[18]的研究结果。本研究所采集的样本均来自散养户，与规模化养殖不同，散养动物有食物天然（放牧）以及抗菌药物使用量少等优势，但在这种情况下依然出现耐药率高的现象，应引起注意。结合羊源鼻拭子也有检出耐药粪肠球菌的情况，可能是在放牧过程中所接触的土壤、水及空气中存在耐药基因；也可能养殖人员携带耐药菌，或养殖环境中有野生动物携带，比如野鼠等。这一现象警示我们，平时常说的“纯天然绿色食品”的家养动物可能也无法逃离耐药菌的侵袭。此外，值得注意的是，羊源鼻、肛拭子粪肠球菌中均检出利奈唑胺耐药菌，且鼻拭子粪肠球菌的耐药率高达42.5%，远高于王舒丰等[19]的结果。利奈唑胺被认为是治疗耐万古霉素肠球菌的最后关卡，应严格规范该药物的使用，尽可能延长耐万古霉素肠球菌出现的时间。不同动物源粪肠球菌对庆大霉素的耐药率较低，且均为低水平耐药，但也应提高警惕，尽量延长粪肠球菌对庆大霉素产生高水平耐药的时间，因为它可能会打破氨基糖苷类和β-内酰胺类以及糖肽类抗菌药物的协同杀菌作用[20]。牛源粪肠球菌的耐药率普遍较低，这可能是由于每个散养户养殖牛的数量较少，且饲养过程中没有用过抗菌药物。鸡源粪肠球菌对四环素类药物的耐药情况最差，其次是红霉素，但本研究结果均低于蒋逸凡等[21]的研究结果。通过对畜主走访调研了解，鸡在饲养过程中并未大量使用抗生素，食物来源也是自产的小麦及玉米，这可能是其耐药率低于规模化养殖场的原因。但这样的结果也不容乐观，再一次证明“纯天然”家养动物也可能将其携带的耐药菌株通过饲喂、屠宰、食品加工、销售等过程传递给人。从这一现象也可以推测，伊犁昭苏地区的环境被耐药菌污染的可能性较大，平时应做好环境消杀工作，并处理好动物的排泄物，以免污染当地水源，导致耐药菌的广泛传播。

从耐药基因的检测结果来看，伊犁昭苏地区不同动物源粪肠球菌中耐药基因的携带率较高，对被检测的6 大类耐药基因均有检出。其中，羊源粪肠球菌中耐药基因的检出率最高，ermB、fexA、optrA、tet(M)和aph(3’)-Ⅲ的检出率均在70.0%以上，与其耐药表型基本一致。结合羊源粪肠球菌对庆大霉素和利奈唑胺的耐药率及中介率，证明在中介菌株中也能检出相关耐药基因，应加强监测。氟苯尼考是动物专用药，在动物体内的耐利奈唑胺肠球菌与其在临床长期使用有着密切关系[22-23]。本研究中optrA检出率较高，该基因可介导细菌对利奈唑胺产生耐药性，为避免引发交叉耐药，在饲养过程中应谨慎使用此药物。牛源粪肠球菌的耐药基因检测结果中，aph(3’)-Ⅲ和fexA的检出率低于其相对应药物的耐药率，这可能由于菌株携带有未检测的耐药基因或新的耐药基因。在鸡源粪肠球菌中，aph(3’)-Ⅲ和optrA的检出率略高于其相对应药物的耐药率，这可能是由于耐药基因在菌体内未表达，这些携带耐药基因的菌株在药物选择压力下转变成耐药菌株。此外，3 种动物源粪肠球菌中外排泵基因emeA的检出率均在80.0%以上，该基因可介导粪肠球菌对多种不同结构的抗菌药物（如庆大霉素、红霉素、环丙沙星、新生霉素等）产生外排作用[16]，降低细菌内药物的有效含量，从而导致疗效下降。

综上所述，新疆伊犁昭苏地区羊源粪肠球菌的耐药性非常严重，相关耐药基因的检出率较高，因此红霉素、四环素、多西环素和氟苯尼考应考虑不再继续使用或谨慎使用；牛源粪肠球菌耐药情况相对较好，但也应持续监测，避免耐药程度的加剧。此外，该地区应加强环境的消杀管理，特别是动物排泄物的规范化处理，避免排泄物中的耐药菌由环境向人或动物传播。