荷斯坦牛脐带间充质干细胞分离鉴定及分化研究

宗俊霖， 王亚芹， 刘彦辰， 许龙， 关伟军*

（1.佳木斯大学生物与农业学院，黑龙江 佳木斯 154007； 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193）

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有增殖能力、多谱系分化能力和免疫调节特性而成为具有吸引力的细胞[1]。MSCs 首次从骨髓组织中分离鉴定出来，并一直被认为是再生医学的良好种质资源[2]。与骨髓干细胞不同，脐带来源的间充质干细胞（umbilical cord MSCs，UCMSCs）具有无痛的收集程序和更快的自我更新特性，不同的衍生方案可能提供不同数量的干细胞，同时在脐带的不同组织（如华通胶、周围血管）中可以分离出干细胞；与胚胎干细胞相比，具有更小的伦理道德争议和更大的安全性。脐带血来源的造血干细胞被称为“珍贵的生命备份”[3]，脐带血的生物银行业务在世界范围内很常见，包括公共和私人服务[4]。MSCs 已经被证实可用于治疗部分疾病，如在脑缺血大鼠模型中，人类脐带间质干细胞（human UCMSCs，hUCMSCs）可以分化、移植并成功获得功能,其还对帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、多发性硬化症、视网膜疾病、1 型和2 型糖尿病以及肌源性疾病等具有一定的治疗效果[5]。在干细胞的移植治疗中，免疫反应一直是危险因素之一，而UCMSCs 具有低免疫和免疫调节作用，可以增加移植细胞的存活率，降低移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）的风险[6]。

近几十年来，关于畜禽干细胞系资源的研究进展较为缓慢，猪(Sus scrofa)[7]、山羊(Capra hircus)[8]、绵羊(Ovis aries)[9]和鸡(Gallus gallus)[10]的部分胚胎干细胞研究近些年才获得初步进展。牛来源的MSCs 因其同样存在再生潜力和可塑性，同时，MSCs 在分离培养或复苏培养后仍具有抗炎促进再生的能力，使得异体来源的干细胞治疗在临床上更具吸引力[11]。而牛MSCs 可从子宫、脐带、骨髓、脂肪组织、胎盘和羊水等多种机体组织中分离出来，研究证实其对牛乳腺炎、糖尿病和卵巢营养不良导致的生育问题都有一定的治疗效果[12-14]。本研究以3 月龄荷斯坦牛脐带为材料进行原代培养及诱导分化潜能研究，不仅可以为今后研究UCMSCs 提供试验材料，还可以为再生医学提供新细胞来源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验动物 3 月龄健康荷斯坦牛胚胎由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地提供，实验动物伦理审查编号为IAS2023-2。

1.1.2 主要试剂 胰蛋白酶（trypsin）、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、DMEM/F12培养基、多聚甲醛固定液、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）购自塞维尔公司；胶原酶Ⅳ购自Sigma公司；DAPI、封闭用山羊血清、FITC标记山羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；CD29、CD44、CD90、CD166 一抗购自美国Abcam 公司；Trizol 试剂购自美国Invitrogen 公司；逆转录试剂盒、2×ESTaqMasterMix 和ddH2O 购自TaKaRa 公司；表皮细胞生长因子 (epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维生长因子（bFGF）均购自英国Perotech 公司；Giemsa 染色液、油红O、阿利辛蓝染色液和茜素红染色液购自索莱宝公司。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.1.3 主要仪器 TE-2000-E 共聚焦显微镜，日本Nikon；TH4-200 倒置生物学显微镜和DP-12 图像采集系统、BB160UV/BB5060UV CO2 培养箱，德国Heraeus；激光共聚焦显微镜，德国徕卡；无菌超净工作台，哈尔滨哈东联电子技术开发有限公司;离心机，德国Eppendorf 公司；细胞过滤器（80 μm 尼龙网），美国BD 猎鹰；蛋白分析仪，BioDrop；LA Taq仪器，日本TaKaRa。

1.2 方法

1.2.1 UCMCs 的分离培养 在无菌条件下用眼用剪刀切开牛胚胎绒毛膜，将整个脐带组织分离出来，并放置在装有PBS 的无菌培养皿中进行清洗。剪断华通胶和血管并将其切碎，用0.1%的Ⅰ型胶原酶在37 ℃下消化45 min。消化后悬浮液使用细胞过滤器过滤，1 200 r·min-1离心15 min，添加细胞培养基（DMEM/F 12、12%胎牛血清、10 ng·mL-1bFGF、10 ng·mL-1EGF、100 mg·mL-1青霉素和0.1 mg·mL-1链霉素），在细胞培养箱（温度37 ℃、CO2含量5%）中培育。使用共聚焦显微镜观察到细胞的汇合度达到80%～90%时，弃去旧培养基，用1 mL 0.25% 的胰蛋白酶（含0.01%EDTA）消化细胞2 min，再使用1 mL 细胞培养基传代培养。由于上皮细胞对胰蛋白酶不敏感，在第4代（P4）后，细胞一般被纯化。

1.2.2 UCMSCs 克隆能力和细胞生长曲线绘制取第5（P5）、第10（P10）、第15（P15）代细胞消化计数后，分别稀释至100 cell·mL-1，各取1 mL悬液接种在60 mm 培养皿中培养10 d 后。使用4%多聚甲醛固定15 min，后用Giemsa染色30 min，并在荧光倒置显微镜明场条件下拍照。取第5、第10和第15代细胞以104cell·mL-1接种于24孔微孔板中。每天随机选取3 个孔计数细胞，以每天计数平均值绘制生长曲线，并计算种群倍增时间（population doubling time，PDT）。

式中，t0为对数生长开始时间，t为对数生长结束时的时间，N0为对数生长开始时的细胞数，Nt为对数生长结束时的细胞数。

1.2.3 免疫荧光染色分析 培养的细胞在室温下除去旧培养基，用1 mL 4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤3 次，加入1 mL 0.2% TritonX-100 裂解15 min 后吸除裂解液，PBS 洗涤1 次，用1 mL 10%正常山羊血清封闭1 h 后将细胞与BSA 稀释的一抗在避光的冰箱中（BAS∶抗体=100∶1）过夜。然后将样品与山羊抗兔FITC 标记的二抗偶联，在室温下避光孵育1 h，然后参照说明书用DAPI 染色15 min。使用激光共聚焦显微镜观察荧光。

1.2.4 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 使用Trizol 试剂裂解第5 代UCMSCs 和诱导后的细胞，加入10 μL DEPC 水溶解总RNA。用蛋白分析仪在260 nm 处的吸光度测定RNA 含量。使用反转录试剂盒对1 mg 总RNA 进行反转录。NCBI 网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载CD29、CD73、

CD90、CD166、CD45、LPL、PPAR-γ、COL-Ⅰ、OPN、ACAN、SOX9基因序列并设计引物（表1），以GAPDH作为内参进行PCR。反应体系为：2×ESTaqMasterMix 25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 补至50 μL。反应程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 min，72 ℃延伸30 s，25 个循环；72 ℃终延伸2 min。反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察干细胞相关标志基因表达情况。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.2.5 体外成骨诱导 取第5 代长势良好的UCMSCs 在成骨诱导培养基（DMEM/F 12 培养基，10%胎牛血清、0.5 mmol·L-1地塞米松、10 mol·L-1甘油磷酸盐和50 mmol·L-1维生素C）中培养。每4 d 更换1 次成骨培养基，21 d 后使用移液枪去除培养基，参照说明书用1 mL茜素红液染色15 min，显微镜明场条件观察是否有红色骨结节出现。对诱导后细胞以RT-PCR，检测OPN和COL-I基因以确定是否诱导成功。

1.2.6 体外成脂肪诱导 将第5 代长势良好、汇合度在70% 的细胞置于成脂肪诱导培养基（DMEM/F 12 培养基培养，其中添加10%胎牛血清，0.5 mmol·L-1吲哚美辛，10 mmol·L-1胰岛素，1 mmol·L-1地塞米松和IBMX）中培养，每4 d 换液1 次培养基，持续培养12 d 后吸除旧培养基，参照说明书采用油红O 染液1 mL 染色15 min,显微镜明场下观察是否有红色脂滴。对诱导后细胞RTPCR，检测LPL和PPAR-γ基因以确定是否被诱导成功。

1.2.7 体外成软骨诱导 将第5 代生长状态良好的细胞置于软骨诱导培养基（DMEM/F12 培养基，2.5% 胎牛血清，1% ITS，50 μg·mL-1脯氨酸，0.9 mmol·L-1丙酮酸钠，10 μg·mL-1TGF-β3,50 μg·mL-1抗坏血酸）中培养，每4 d 更换1 次培养基，培养21 d后吸除旧培养基，参照说明书用阿利辛蓝1 mL 染液染色15 min，显微镜明场条件下观察是否有蓝色多糖团的形成，对诱导后细胞进行RT-PCR，检测ACAN和SOX9基因以确定是否成功诱导。

2 结果与分析

2.1 UCMSCs的形态分析

从图1 可以看出，实质分离的细胞（P1）呈长梭形紧密排列粘附在培养皿上，并与一些菱形的上皮样细胞混合。第10代（P10）时菱形状上皮样细胞消失，并获得了1 个全部为长梭形贴壁的细胞群。在后代中，没有发现明显的形态差异。然而，第30代（P30）细胞的形态表现出萎缩、细胞间间隙变大、空泡化等一系列衰老特征。

2.2 克隆形成和生长能力分析

从图2可以看出，3代细胞的生长曲线均为典型的“S”形，经过2 d缓慢增长时期，第3天进入对数生长期，在第5天进入数量稳定时期。通过计算，其种群倍增时间各不相同，第5代（P5）细胞群体倍增时间最短，随着代次升高群体倍增时间升高。

图2 荷斯坦牛UCMSCs生长曲线和群体倍增时间Fig. 2 Growth curves and population doubling time of Holstein cattle UCMSCs.

显微镜下观察到Giemsa染色的3个代次具有不同大小的紫色细胞团（图3），可知UCMSCs具有克隆团形成潜力，第5（P5）、第10（P10）和第15 代（P15）都具有形成细胞克隆团的能力。克隆团内的细胞也成漩涡状排列，直径和密集度随着细胞代次升高而减小。

图3 荷斯坦牛UCMSCs克隆团形态Fig. 3 Clone group morphology of Helstein cattle UCMSCs

2.3 UCMSCs免疫荧光分析

免疫荧光检测结果（图4）显示，UCMSCs 特异性标记基因CD29、CD44、CD90和CD166均呈阳性表达，绿色荧光显示细胞形态清晰边缘明显，DAPI显示细胞核清晰可见。原始造血祖细胞标志物CD45为阴性,符合UCMSCs表面标志物的特性，表明从荷斯坦牛脐带中成功分离出UCMSCs。

图4 免疫荧光检测荷斯坦牛UCMSCs表面标志物Fig. 4 UCMSCs markers detection by immunofluorescence staining in Holstein cattle

2.4 多能性相关基因RT-PCR表达分析

RT-PCR 结果（图5）显示，UCMSCs 特异性标记基因CD29、CD73、CD90、CD166和内参GAPDH均阳性表达，而造血干细胞特异性标记基因CD45阴性表达。与免疫荧光的结果对应，同时也符合国际细胞治疗协会（International Society for Cellular Therap，ISCT）对于MSCs 表面标志物的规定[27]。

图5 RT-PCR检测标记基因的表达Fig. 5 Marker genes expression by RT-PCR

2.5 UCMSCs体外多向诱导分化能力分析

2.5.1 诱导成骨能力分析 成骨诱导21 d后使用茜素红染色（图6），细胞形态变为多边形，可见细胞间散落分布沉积的块状钙盐结节被染成红色。RT-PCR 结果显示，诱导后的细胞表达骨细胞关键基因COL-I和OPN。

图6 荷斯坦牛UCMSCs分化成骨染色和RT-PCR结果Fig. 6 Osteoblast differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

2.5.2 诱导成脂肪能力分析 成脂诱导12 d后使用油红O试剂盒染色（图7），诱导后的细胞由长梭形转变为椭圆形和扁圆型，细胞浆内可见橘红色不透明圆形油滴。RT-PCR 的结果显示脂肪细胞脂蛋白脂酶（LPL）和过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPAR-γ）基因均表达。

图7 荷斯坦牛UCMSCs分化成脂染色和RT-PCR结果Fig. 7 Adipogentic differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

2.5.3 诱导成软骨能力分析 成软骨诱导21 d后使用阿利新兰染色液染色（图8），诱导后的细胞形态变得细长，向被染成蓝色的黏多糖的软骨结节聚集成软骨关键基因ACAN和SOX9均表达。

图8 荷斯坦牛UCMSCs分化成软骨染色和RT-PCR结果Fig. 8 Chondrocyte differentiation of Helstein UCMSCs and RT-PCR result

3 讨论

脐带是将胚胎附着于胎盘之上的器官，本身存在着血管（包括2条脐带动脉和1条脐带静脉），保证怀孕期间胚胎的氧气和营养物质输送，是造血干细胞的重要来源器官[15]。脐带MSCs可以从整个脐带组织中获得，如羊膜上皮膜(amnion，AM)、脐带内膜(subamnion，SA)、华通氏胶(Wharton’s jelly，WJ)和脐血管周围区域(perivascular,PV)[16]。目前对脐带内细胞分离主要采用组织块贴壁法和酶消化法，组织块贴壁法是将脐带整个组织剪碎贴壁后再加入培养基的方法。相比于酶消法，组织块贴壁法受影响的因素存在不确定性，组织块的大小、部位都可能影响细胞生长，而酶消法能够更加稳定获得所需MSCs。在对细胞传代培养时，原代细胞会混杂一些血管内皮样细胞和血细胞，传代培养后细胞被纯化，随着传代次数的增加，细胞的克隆形成能力开始下降，群体倍增时间开始增加，说明随着细胞分裂次数的增加，细胞衰老程度开始增长。

本试验分离培养出的UCMSCs 符合ISCT 的最低标准，即在标准条件下贴壁生长，特异性抗原阳性，而造血干细胞抗原呈阴性并且同时具有三向诱导分化的能力。表面标志物的荧光鉴定是干细胞鉴定的关键部分，不同物种分离的间充质干细胞表面标志物无明显差异，都表达CD29、CD90、CD73和CD105，不表达CD45[17-18]。其中，CD45为白细胞的共同抗原，不存在于间充质干细胞中，CD105是内皮糖蛋白，是一种位于细胞膜表面的Ⅰ型跨膜糖蛋白，是转化生长因子-β（TGF-β）受体复合物之一。CD105 是调节与转化生长因子、骨形成蛋白2（BMP-2）和骨形成蛋白7（BMP-7）结合相关的反应，此外，它还参与血管生成的调节，表达于多种细胞，包括胚胎干细胞、分化细胞和癌细胞,参与细胞间相互作用[19]。

在体外不同培养条件下诱导分化也是鉴别间充质干细胞的重要环节，本研究表明，UCMSCs 能够在体外分化为脂肪、软骨、骨3 种中胚层细胞，说明其具有良好的分化能力。骨细胞相关标记蛋白包括Collage type Ⅰ和OPN。Collage type Ⅰ是胶原蛋白家族的一员,广泛存在于各种器官的软骨组织中,占骨主要成分的80%[20]；OPN 标志着向骨细胞分化的成熟早期[21]，诱导成脂肪的标志物包括LPL 和PPAR-γ， PPAR-γ 属于配体激活转录因子的核激素受体超家族，作为诱导脂肪细胞分化的主要标志因子[22]。软骨基因标志物ACAN 控制软骨主要成分蛋白聚糖的合成，SOX9作为一种主转录因子，主要调控一系列控制软骨形成下游因子[23]。MSCs 的体外三向诱导分化能力因其组织来源的不同而存在差异，Karahuseyinoglu 等[24]证明，脐带来源的MSCs 向脂肪分化的能力低于骨髓来源的MSCs,而向软骨细胞和骨细胞分化的能力高于骨髓来源的MSCs。其还有向内外胚层衍生细胞如胰岛细胞和肝细胞分化分化的潜能，Zheng 等[25]通过修改肝源性分化方案发现肝细胞分化组细胞具有肝细胞功能。CHAO 等[26]使用神经条件培养基逐步培养UCMSCs，发现诱导后的细胞不仅表达胰岛β 细胞的特异性基因，同时在移植到糖尿病大鼠模型中能够释放胰岛素。可能由于缺少体内微环境的调节，在体外诱导成的不同细胞会受到诱导条件和细胞来源影响，因此本试验中诱导分化获得细胞尚需更详尽的方案来评价其多方面的功能。

综上，本研究成功从3月龄荷斯坦牛胚胎脐带组织中分离，细胞形态均一，呈长梭形，并保持了好的增殖能力，具有向脂肪、骨和软骨样细胞分化,具有较高的分化潜能。有望在细胞治疗方面发挥潜力,为组织工程学提供新的种子细胞。