孕穗期低温对水稻叶片生理、产量的影响及外源褪黑素缓解效应

单莉莉

（黑龙江省农业科学院水稻研究所，黑龙江 佳木斯 154026）

水稻是我国重要的粮食作物之一[1]，在国民经济中占有非常重要的地位，种植面积占全球的19.10%，产量居世界第一，种植面积和总产均居我国粮食作物首位[2]，水稻产量稳定对我国粮食安全有重要的战略意义。水稻起源于热带地区，是喜温植物[3]，对低温较为敏感。近年来，全球气候变化频繁且异常，我国东北地区夏季频发低温，对水稻生产造成较大影响。低温冷害引起水稻减产是世界范围内普遍存在的问题，不同地区的水稻品种在其生育期内会遭受不同程度、不同类型的低温危害[4]。营养生长时期，低温胁迫能够引起幼穗分化减缓并导致抽穗延迟[5]；生殖生长时期，低温胁迫能够导致雄配子不育、增加水稻籽实空壳率，最终引起减产[6]；在灌浆阶段遭遇低温则导致籽粒成熟不良和产量降低[5]。

水稻在孕穗期遭受低温胁迫，能够引起花粉败育，导致水稻结实率降低，此时期如遭遇极端低温甚至可引起花粉全部丧失育性，存在绝产的可能性。N-乙酰基-5-甲氧基色胺又名褪黑素（melatonin，MT），是广泛存在于植物、动物、原核生物体内的一种吲哚类小分子[7]。在植物体内，MT具有清除自由基保护细胞免受伤害、提高植物抗逆的能力[8]。研究表明，低温胁迫下外源MT 能提高大豆幼苗的抗寒能力，增强光合作用并提高其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）活性[9]；对烟草幼苗的低温胁迫研究也发现，外源MT 能够通过降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、提高可溶性糖和可溶性蛋白含量来提高幼苗对低温的耐受性[10]。史中飞等[11]研究表明，外源MT处理通过降低质膜过氧化水平、保持细胞膜的完整性来增强油菜幼苗对低温的适应性。外源MT 可显著提高砷胁迫下水稻叶片和根系中的SOD、POD 和CAT 活性并降低MDA 含量，降低膜脂过氧化，进而提高水稻抵抗砷胁迫的能力[12]；叶面喷施MT能显著提高水稻的耐盐性[13]，外源MT 浸种能降低MDA 含量并提高SOD、POD活性，从而缓解水淹胁迫对水稻幼苗的毒害作用[14]。

截至目前，国内外关于喷施外源MT 调控作物抵抗水分胁迫[15-16]、抵抗高温强光[17]、抵抗盐碱胁迫[18-19]等领域的研究较多，但未见外源MT 对水稻孕穗期低温调控的相关报道。本文在已有研究的基础上，开展孕穗期低温对水稻叶片逆境生理指标和结实率影响的研究；同时开展预喷施外源MT缓解冷害的效果研究，旨在探明水稻孕穗期对低温的应激响应及外源MT 对冷害的调控效应，以期为水稻防控冷害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021 年在黑龙江省农业科学院耕作栽培研究所盆栽场和人工气候室进行。选用龙粳11（LJ11，冷敏品种）和龙稻5（LD5，耐冷品种）为试验材料，该供试品种的耐冷性已由项洪涛等[3]研究证实。供试褪黑素（MT）购自北京索莱宝科技有限公司，纯度≥99.0%。

1.2 试验设计

试验采用盆栽方式栽插，每盆保苗3株[3,20]，在孕穗期进行预喷施外源MT及低温处理。试验共设置3 个处理（表1），每处理3 次重复。处理当天上午6点，选择叶枕距在-3～0 cm 之间的有效分蘖进行挂牌标记，低温处理温度设定为16 ℃。8∶00 叶面喷施浓度100 μmol·L-1外源MT，用液量为22.5 mL·m-2，以喷施等量清水为对照。喷施后即进行低温处理，持续5 d。

表1 试验设计Table 1 Test design scheme

1.3 取样方法

处理期间，每天取样1 次，共取样5 次，每天8∶30 各不同处理单独取样，迅速取下标记分蘖的叶片并装入样本袋内（标记好编号），然后迅速放入液氮中，待叶片样本完全冷冻后，移至-80 ℃冰箱中保存，用于逆境生理指标测定[3,20]。

低温处理后，取样期间各不同处理每天解除低温胁迫材料15 盆，并移至室外，常规管理直至成熟，供结实率调查使用[3,20]。

1.4 测定方法

人工调查结实率；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法测定MDA 含量，采用氮蓝四唑（nitrogen blue tetrazolium，NBT）法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，采用考马斯亮蓝G-250 染色法测定可溶性蛋白含量，具体步骤按照李合生等[21]的方法；采用碘化钾方法测定H2O2含量，具体步骤参照Chakrabarty 等[22]的方法；采用硫酸蒽酮（anthrone sulfate）比色法测定可溶性糖含量，采用茚三酮比色法（ninhydrincolorimetric）测定脯氨酸（proline，Pro）含量，具体步骤按照张宪政[23]的方法。

1.5 数据处理

试验所有数据处理采用Excel 2010 和DPS 19.05进行统计分析，文中涉及各表内试验数据均为平均值±标准误，试验数据均为3次重复的平均值，选择新复极差法进行显著性差异检验。

2 结果与分析

2.1 孕穗期低温及外源褪黑素对水稻结实率的影响

水稻孕穗期低温胁迫可影响其结实率，但不同的耐冷型品种之间差异明显。由表2 可知，孕穗期低温对耐冷品种龙稻5 的影响不明显，对冷敏品种龙粳11 影响非常明显。随着低温时间的持续，龙稻5的结实率几乎没有变化，龙粳11结实率降低幅度较大。方差分析结果表明，经过1～5 d的低温处理，龙稻5的T1处理与CK之间均没有显著差异，而龙粳11 的T1 处理较CK 分别极显著下降了5.96%、12.99%、21.80%、32.06%和45.26%。喷施外源MT对龙稻5的结实率调节效应微弱，对龙粳11效果显著。经方差分析可知，龙粳11低温处理1～5 d，与T2相比，T1结实率分别极显著提高了3.13%、7.81%、11.72%、16.64%和9.03%。

表2 不同处理下水稻的结实率Table 2 Seed-setting of rice under different treatments（%）

2.2 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片膜脂过氧化的影响

2.2.1 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片丙二醛含量的影响 丙二醛（MDA）是膜质过氧化的最终产物，具有细胞毒性，其含量反映植物逆境受损情况[3,20,24]。由图1可知，低温处理后，水稻叶片MDA含量表现为逐步增加的变化规律。处理1～5 d时，龙稻5 T2处理的MDA含量较CK分别极显著提高了8.75%、10.66%、14.27%、16.43% 和17.52%；龙粳11 T2 的处理MDA 含量较CK 分别极显著提高了11.69%、10.44%、13.46%、27.49%和42.14%。喷施外源MT对叶片MDA含量具有明显的调控效应，与T2 处理相比，T1 可显著或极显著降低叶片MDA 含量。处理1～5 d 的龙稻5，T1 处理较T2 分别显著下降了4.89%、5.00%、4.89%、4.94% 和1.92%。对龙粳11 来说，处理1 d 时，T1 处理较T2显著下降了5.38%；处理2～5 d，T1 处理较T2 分别极显著下降了4.08%、2.90%、7.94%和15.44%。

2.2.2 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片过氧化氢含量的影响 过氧化氢（H2O2）是重要的活性氧类自由基，通常表现为过量积累时产生毒害作用，其含量越高，细胞膜受损越严重[25]。由图2可知，经过低温处理后，水稻叶片内的H2O2含量呈逐渐升高的变化趋势。就龙稻5而言，处理1～5 d时，T2处理较CK 分别极显著增加48.50%、92.22%、158.79%、178.92%和190.06%。就龙粳11 而言，处理1～5 d时，T2 处理较CK 分别增加46.04%、107.84%、153.50%、161.65%和171.83%，均达到极显著水平。喷施外源MT 能够明显降低H2O2含量，处理1～5 d时，龙稻5 T1 处理较T2 分别极显著下降17.74%、18.38%、20.14%、13.82%和13.10%，龙粳11分别极显著下降14.24%、25.94%、22.09%、15.58%和6.56%。

图2 不同处理下水稻叶片的过氧化氢含量Fig. 2 H2O2 content in leaves of rice under different treatments

2.3 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片抗氧化系统酶活性的影响

2.3.1 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片超氧化物歧化酶活性的影响 超氧化物歧化酶（SOD）

具有清除活性氧自由基的生理功能，其活性越高，对作物的保护能力越强[3,20,26]。如图3 所示，低温处理后，水稻叶片SOD 活性表现出“单峰曲线”的变化趋势，且2 个品种均在处理后第4 天达到峰值。对龙稻5 来说，与CK 相比，处理1 d 时，T2 处理SOD 活性显著提高2.30%，处理2～5 d 时，T2 处理SOD 活性分别极显著提高5.58%、8.90%、13.23%和2.82%；对龙粳11 来说，处理1～5 d 时，T2 处理SOD 活性分别较CK 极显著提高3.00%、5.87%、6.31%、7.76%和4.54%。喷施外源MT 可提高水稻叶片SOD 活性，尤其喷施后1～2 d 效果更为显著。对龙稻5 而言，处理1～3 d 时，T1 处理较T2 分别极显著提高2.80%、3.67%和3.95%，处理4～5 d 时，T1 处理较T2 分别显著提高2.32%和2.34%；对龙粳11 来说，处理1～2 d 时，T1 处理较T2 分别极显著提高3.27%和2.42%，处理4～5 d时，T1 处理较T2 分别显著提高2.06%、2.51%和3.25%。

图3 不同处理下水稻叶片的超氧化物歧化酶活性Fig. 3 SOD activity in leaves of rice under different treatments

2.3.2 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片过氧化物酶活性的影响 过氧化物酶（POD）具有清除H2O2的生理功能，POD活性越高，植物的抗逆性越强[26]。由图4 可知，经过低温处理后，水稻叶片内POD 活性的变化趋势与SOD 活性相同，亦表现为“单峰曲线”，且均在处理第4天达到峰值，之后开始下降。具体来看，低温引起水稻叶片内的POD活性增加，就龙稻5 来说，处理1 d 时，T2 处理较CK 显著提高8.18%，处理2～5 d 时，T2 处理较CK分别极显著提高40.76%、70.83%、99.10% 和40.63%；就龙粳11 而言，处理1～5 d 时，T2 处理较CK 分别极显著增加11.17%、50.87%、78.94%、105.32%和45.07%。喷施外源MT 能够进一步提高POD活性，处理1～5 d时，龙稻5的T1处理较T2分别极显著增加18.00%、11.44%、9.17%、10.32%和13.30%；龙粳11 的T1 处理较T2 分别极显著增加7.99%、6.14%、5.42%、6.42%和5.88%。

图4 不同处理下水稻叶片的过氧化物酶活性Fig. 4 POD activity in leaves of rice under different treatments

2.3.3 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片SOD/POD 的影响 SOD/POD 比值越小，作物的抗氧化能力越强。由表3 可知，经过低温处理后，水稻叶片内的SOD/POD变小，且均在处理第4天时最低，整体表现出先下降后上升的变化趋势。龙稻5在处理1 d 时，叶片内的SOD/POD 比值T2 处理显著低于CK，在处理2～5 d时，T2处理均极显著低于CK；龙粳11在处理1～5 d时，T2处理均极显著低于CK。喷施外源MT 可进一步降低水稻叶片SOD/POD比值，龙稻5在处理1～5 d时，T1处理均显著或极显著低于T2；龙粳11在处理1 d时，T1处理极显著低于T2，在处理2～3 d时，T1处理显著低于T2，在处理4～5 d时，T1与T2处理之间无显著差异。

表3 不同处理下水稻叶片的SOD/POD比值Table 3 SOD/POD ratio in leaves of rice under different treatments

2.4 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片渗透调节物质含量的影响

2.4.1 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片可溶性蛋白含量的影响 可溶性蛋白是亲水性胶质，含量越高，细胞保水力越强，进而降低逆境伤害程度[27]。由图5 可知，低温处理后，水稻叶片内可溶性蛋白含量呈逐渐增加的变化规律。对龙稻5 来说，处理1～5 d，T2 处理较CK 分别极显著增加13.39%、18.90%、29.37%、31.84%和42.92%；对龙粳11 而言，处理1～5 d，T2 处理较CK 分别极显著增加11.55%、19.86%、26.64%、33.50%和37.69%。喷施外源MT 进一步提高了水稻叶片内可溶性蛋白含量，对龙稻5 来说，处理1～5 d，T1 处理较T2分别极显著提高6.85%、12.71%、10.13%、10.06%和10.69%；对龙粳11 来说，处理1～5 d，T1 处理较T2 分别极显著提高6.63%、11.17%、9.39%、9.96%和11.41%。

图5 不同处理下水稻叶片的可溶性蛋白的含量Fig. 5 Soluble protein content in leaves of rice under different treatments

2.4.2 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片可溶性糖含量的影响 可溶性糖能增加细胞束缚水含量，进而增强细胞液流动性，促进细胞免受逆境损伤[27]。由图6 可知，低温处理后，水稻叶片内可溶性糖含量逐步提高，喷施外源MT 进一步提高了可溶性糖的含量。对龙稻5 来说，处理1～5 d，T2处理较CK 分别极显著提高16.21%、25.34%、37.67%、40.22%和42.16%；T1处理较T2分别极显著提高5.15%、5.13%、7.50%、7.23%和8.22%。对龙粳11 而言，处理1～5 d，T2 处理较CK 分别极显著提高21.58%、33.47%、45.50%、48.73% 和51.51%；T1 处理较T2 分别极显著提高7.10%、6.28%、4.38%、4.47%和4.93%。

图6 不同处理下水稻叶片的可溶性糖的含量Fig. 6 Soluble sugar content in leaves of rice under different treatments

2.4.3 孕穗期低温及外源MT 对水稻叶片脯氨酸含量的影响 脯氨酸具有促进细胞束缚水含量积累的生理功能，其含量越高，降低细胞水势越明显，进而提高细胞抵御低温的能力[27]。由图7 可知，低温处理后，水稻叶片内脯氨酸含量逐步增加，喷施外源MT 进一步增加了脯氨酸的含量。对龙稻5来说，处理1～5 d，T2处理较CK分别极显著提高15.12%、42.32%、68.72%、82.49% 和95.38%；T1 处理较T2 分别极显著提高22.36%、14.00%、12.52%、10.56%和8.67%。对龙粳11 而言，处理1～5 d，T2 处理较CK 分别极显著提高9.11%、20.81%、35.58%、50.31%和59.30%；T1 处理较T2 分别极显著提高17.01%、22.02%、11.14%、7.74%和8.14%。

图7 不同处理下水稻叶片的脯氨酸的含量Fig. 7 Proline content in leaves of rice under different treatments

3 讨论

3.1 孕穗期低温对不同耐冷性水稻品种结实率的影响

低温是影响作物生长发育及产量的最主要逆境之一[28]。寒地水稻在我国水稻生产中占有举足轻重的地位，特殊的地理位置和气候变化导致低温冷害频发[29]。孕穗期持续低温会导致结实率降低，且在不同品种间存在差异[30]，同一品种在相同的低温环境下，低温持续时间越长对结实率的影响越严重[31]。本研究发现，龙粳11 和龙稻5 对低温的应激反应不同，龙稻5对低温钝感，16 ℃条件下处理5 d 其结实率仍未发生显著下降，而龙粳11 在16 ℃处理后，短时间内结实率就极显著下降，随着处理时间的持续结实率下降速率和幅度增大，这与曾宪国等[32]、项洪涛等[3,20]的研究结果相同。说明孕穗期低温引起水稻结实率降低，对水稻产量造成影响，这与孕穗期低温导致花粉育性下降有直接关系[30]。

3.2 孕穗期低温对水稻叶片细胞膜的损伤以及MT的缓解效应

内源激素调节植物的生长发育，并调控其对胁迫的响应[33]。MT 是一种普遍存在于植物体内的新型植物激素，不仅能够调节植物多种生长发育过程，还能调节植物对多种非生物胁迫的抗性[34]，并通过调控穗数、穗粒数和千粒重等产量因子变化，达到相对提高作物产量的效果[35]。本研究表明，外源MT 能在一定程度上缓解低温对水稻结实率的影响，这与叶君等[35]的研究结果一致。这可能与外源MT 维持了细胞膜的流动性有关，低温条件下植物会产生过量的MDA 和H2O2，MDA 是细胞膜过氧化的产物，其含量可作为质膜受损的重要指标[36]，过量的MDA 不利于细胞膜磷脂分子的排列，并影响细胞膜内不饱和脂肪酸的含量和占比，进而影响细胞膜的流动性和选择透性，造成生理损伤。本研究也表明，低温会引起水稻叶片MDA 和H2O2含量急速增加，但喷施外源MT 可以显著或极显著降低MDA 和H2O2含量，这与陈莉等[37]在棉花上的研究结果一致。娄慧等[38]也指出，低温胁迫下外源MT 能有效减少MDA 和H2O2的产生和积累，缓解低温胁迫对细胞的伤害，增强其对低温逆境的抵抗能力。

3.3 孕穗期低温对水稻叶片抗氧化系统及渗透调节物质含量的影响

正常温度下，植物能自动调节活性氧类物质的产生和清除，使其在体内处于动态平衡状态。但在低温条件下，水稻生长受到抑制，导致叶片内活性氧类物质过量积累并加剧膜脂过氧化程度[39]。植物通过SOD、POD 等抗氧化酶的协同作用，维持活性氧代谢平衡，有效清除细胞内多余的活性氧，降低水稻细胞膜的伤害[40]。SOD 作为抗氧化过程中重要的活性酶，具有清除超氧自由基的特性，但也伴随着产生过量的H2O2，而POD 具有清除H2O2的功能，所以SOD/POD 比值可以作为衡量作物抗氧化能力的指标，SOD/POD 比值越低，其抗氧化能力越强。植物在遭受低温胁迫的同时，还会遭受渗透胁迫和水分胁迫，一些具有保水作用的渗透调节物质如可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等物质的含量会增加，以维持细胞的渗透平衡，降低低温对作物的损伤[41]。可溶性蛋白含量与水稻的抗寒性呈正相关，可溶性蛋白含量越高，水稻的抗寒能力越强[42]。此外可溶性蛋白还能与可溶性糖一起聚集在叶绿体等重要细胞器的周围，保护其免受逆境胁迫损伤[42]。本研究表明，孕穗期低温导致水稻叶片内的SOD 和POD 活性极显著增强，SOD/POD 比值也显著或极显著降低，同时，可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量也极显著增加，说明一旦逆境条件形成，水稻会开启自我保护机制，通过自身的防御系统来抵御低温的伤害。

3.4 外施褪黑素对水稻抗寒性的调节效应

喷施外源MT 对水稻叶片内SOD 和POD 活性具有明显的调控效应，尤其是低温条件下极显著增加了SOD和POD活性、极显著增加了可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，并降低了SOD/POD 比值，说明外源MT 能够缓解低温对水稻的伤害。这与于奇等[43]研究外源MT 对大豆抗寒性的试验结果类似；潘红艳等[44]也明确指出在低温胁迫下，适宜水平的MT 能够有效降低MDA 含量，增强POD活性，表现出更强的抗寒性。