山西糜黍遗传差异评估及分子身份证构建

冯智尊 ，杨雅斐 ，王海岗 ，陈 凌 ，Santra Dipak K ，王瑞云 ，，乔治军

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷030801；2.山西农业大学 农业基因资源研究中心/农业农村部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室/杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，山西 太原 030031；3.内布拉斯加大学 林肯分校农艺系小宗粮豆研究与推广中心，美国 内布拉斯加州 69361）

糜黍（Panicum miliaceumL.）是起源于我国的古老粟类，又称黍稷、黍、稷、糜子、穄，脱壳后称黄米。糜黍有粳糯之分，糜米酸粥、糜子甜饭分别为晋菜和陕菜系列代表，前者由粳性糜子经发酵制作而成，后者则由糯性黍子蒸煮而得。糜黍是我国华北和西北干旱半干旱地区广泛种植的局域性口粮[1-6]。糜黍为C4植物，生育期短（60～90 d），能适应包括生物和非生物胁迫在内的多种逆境，可以高效利用水热资源，在六大洲（亚洲、欧洲、非洲、南美洲、北美洲、大洋洲）均有分布，为边际和土壤贫瘠地区的救灾备荒作物[7-10]。2023 年为国际粟类作物年，契合时代需求，对糜黍作物开展的遗传多样性评估、抗性改良和品质提升等方面的研究日渐增多。糜黍不仅营养丰富，而且还具有保健功能，对乳糜病、肥胖症、褥疮等均具有一定的治疗效果。随着国家农业特优战略的实施，糜黍种质资源收集、整理和评估工作陆续展开。糜黍不仅产量低下，而且作为异源四倍体，基因组复杂，与水稻、小麦等大宗作物相比，其研究进展缓慢。目前，全球有糜黍种质资源2 万余份，我国有1 万余份，山西有2 000 余份。若想合理利用如此众多的资源，首先必须搞清其遗传背景，建立精准简便的鉴定体系成为亟待解决的问题[11-14]。

SSR 作为一种分子标记普遍存在于各种作物的基因组中，在糜黍种质资源的遗传多样性分析方面应用较多。HU 等[15]最早使用种间SSR 分析了我国资源的遗传差异。赵飞龙[16]利用15 个SSR 评估了来自我国16 个糜黍主产省的80 个品种的遗传多样性。王瑞云等[17]利用15 个糜黍特异性荧光SSR鉴定来源于我国11 个省（区）的132 份资源，检测到107 个等位变异，每个位点等位变异数为2～14 个，平均7 个；基因多样性指数为0.093 6～0.867 6，平均0.529 8；多态性信息含量为0.089 3～0.853 8，平均0.486 4；基于遗传结构的分析结果显示，我国糜黍资源来自4 个基因库（东北地区、黄土高原、北方地区和西北地区），与基于遗传距离的聚类结果一致，均与材料的地理来源相关。LIU 等[18]采用67 个SSR 分析来自4 个群组的栽培种和地方品种的遗传多样性，共检测到179 个等位变异，有效等位基因数为1.995 个，遗传多样性指数为0.725。何杰丽等[19]基于高通量测序结果设计EST-SSR 引物，分析了国内外不同生态区的144 份资源，利用主成分分析将材料划归7 个类群。王倩等[20]基于转录组测序开发了200 个高基元EST-SSR，多态性筛选后获得52 个多态性标记，多态率为26%；利用上述标记检测200 份核心资源，发现Shannon 多样性指数变幅为0.309 3～1.091 0，平均为0.727 7。糜黍作物分子身份证的构建工作较少，陈小红等[21]以来源于4 个生态栽培区的130 份资源为材料，基于35 个高基元SSR 构建了DNA 分子身份证。王宇卓等[22]以272 份山西糜黍核心种质为材料，基于ID Analysis 4.0 软件，用20 个SSR 构建了材料的分子身份证。

糜黍是我国起源的特色杂粮作物，而山西是中华民族发祥地之一，在山西省万荣县荆村新石器时代的遗址中就有烧焦的黍穗遗存。在山西，山区面积占全省总面积的80%以上，糜黍的抗旱耐瘠特性使其种植广泛，从北（大同天镇新平堡镇平远头村）到南（运城芮城永乐镇南张村）、从西（运城永济韩阳镇长旺村）到东（大同灵丘柳科乡南坑村）均有吃糜黍食品的习俗，包括糜米酸粥、泡泡油糕、枣介糕、小车刀切糕、黄米粽子、稷米面煎饼、沙棘开口笑、糜米凉粉等，糜黍是天镇、灵丘、河曲、岢岚等晋北冷凉地区的主要农作物之一，在人们的日常生活中不可或缺。

本研究选取山西10 个地市的80 份糜黍资源为材料，评估其遗传差异，并构建了各自的DNA 分子身份证，旨在为加快亲本选育、推动糜黍育种进程提供材料基础和基因资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为80 份糜黍资源，来自山西省除晋城以外的10 个地市，其中，晋北地区48 份（忻州24 份、大同13 份、朔州11 份），晋中地区26 份（晋中14 份、吕梁5 份、太原4 份、阳泉3 份），晋南地区6 份（长治1 份、临汾1 份、运城4 份）。材料明细如表1 所示。

1.2 试验方法

剪取糜黍三叶期叶片，采用改良CTAB 法[23]提取DNA。DNA 的完整度和浓度检测方法同何杰丽等[19]。PCR 扩增程序和反应体系同林元香等[24]。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，硝酸银染色显影。

利用软件PowerMarker 3.25 和PopGen 1.32 计算遗传多样性参数[25-27]。利用东北农业大学开发的资源特征分析软件ID Analysis 4.0 创建分子身份证。基于二进制（0，1）为PCR 扩增产物赋值（有电泳条带记为1，无电泳条带则记为0）。就一份材料而言，每个SSR 检测产生一个数值，多个标记形成的数值组合在一起构成该材料的字符串DNA 分子身份证。使用在线条形码生成器（http：//barcode.cnaidc.com/app/html/bcgcode128.pHP）将对应字符串生成可扫描的条形码DNA 分子身份证。利用二维码在线生成器（https：//cli.im/）将材料基本信息（包括名称、统一编号、来源地、材料类别、字符串和条形码DNA 分子身份证）转化为可扫描的二维码，即为二维码DNA 分子身份证。

2 结果与分析

2.1 多态性SSR 引物的筛选

44 对糜黍SSR 引物序列如表2 所示。

表2 44 对糜黍SSR 引物序列Tab.2 Primer sequences of 44 SSR markers in broomcorn millet

用山西农业大学农学院糜子作物分子育种课题组前期构建的44 对糜黍特异性SSR 引物（表2）扩增80 份糜黍资源，结果发现，21 个标记（RYW3、RYW7、RYW11、RYW14、RYW18、RYW26、RYW28、RYW29、RYW30、RYW31、RYW37、RYW39、RYW40、RYW49、RYW54、RYW56、RYW61、RYW62、RYW65、RYW67 和RYW82）的扩增条带清晰、多态性较好，可以作为候选核心引物用于分子身份证的构建。其中，RYW82 扩增部分糜黍材料的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1 所示。

2.2 基于SSR 的糜黍资源遗传多样性参数分析

由表3 可知，80 份材料在44 个位点共检测出130 个等位变异，平均每个位点检出3 个等位变异；检测到有效等位基因介于1.936 9（RYW16）～2.993 2（RYW67），平均为2.662 6；Shannon 多样性指数（I）介于0.676 8（RYW16）～1.097 5（RYW67），平均为1.016 1；观测杂合度介于0.109 6（RYW6）～0.569 4（RYW16），平均为0.243 6；期望杂合度介于0.487 1（RYW16）～0.670 4（RYW67），平均为0.625 2；Nei's基因多样性指数介于0.483 7（RYW16）～0.665 9（RYW67），平均为0.621 1，检测出多态性信息含量（PIC）介于0.417 0（RYW20）～0.797 4（RYW67），平均为0.660 4。综合PIC 和I值，高于平均值的SSR引物有21 对（RYW3、RYW7、RYW11、RYW14、RYW18、RYW26、RYW28～RYW31、RYW37、RYW39、RYW40、RYW49、RYW54、RYW56、RYW61、RYW62、RYW65、RYW67 和RYW82）。利用ID Analysis 4.0 软件分析，发现16 个标记（RYW62、RYW67、RYW56、RYW65、RYW61、RYW40、RYW37、RYW31、RYW82、RYW29、RYW28、RYW49、RYW39、RYW54、RYW18 和RYW30）组合在一起可区分全部材料。

表3 基于44 对SSR 引物的糜黍遗传多样性参数Tab.3 Genetic diversity parameters of broomcorn millet based on 44 SSR primers

2.3 基于UPGMA 的糜黍资源的聚类分析

基于UPGMA，用16 对引物对80 份糜黍材料聚类，结果如图2 所示，80 份糜黍资源可以划归4 个类群（类群Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。类群Ⅰ（红色）包括21 份材料，其中，忻州最多（23.8%），为5 份；晋中次之（38.1%），为8 份；大同、阳泉均为2 份，占比均为9.5%；朔州、长治、太原、临汾最少，均为1 份，占比均为4.8%。其中，51 号和55 号聚在一起，均来自晋中市；30 号和35 号聚在一起，均来自忻州市。类群Ⅱ（绿色）包括12 份材料，其中，忻州最多（66.7%），为8 份；大同次之（16.7%），为2 份；朔州和晋中均为1 份，占比均为8.3%。其中，37 号和69 号聚在一起，均来自忻州市；28 号、74 号、75 号、76 号聚在一起，也均来自忻州市。类群Ⅲ（蓝色）包括38 份材料，其中，朔州最多（21.1%），为8 份；大同次之（18.4%），为7 份；忻州位列第3（15.8%），为6 份；晋中和吕梁均为5 份，占比均为13.2%；运城和太原较少（分别占比10.5%和5.3%），分别为4、2份；阳泉最少（2.6%），为1 份。其中，9 号、15 号、16 号、21 号聚在一起，均来自朔州；31 号和32 号聚在一起，均来自忻州；79 号和80 号聚在一起，均来自吕梁；62 号和63 号聚在一起，均来自运城。类群Ⅳ（黄色）包括9份材料，其中，忻州最多（55.6%），为5份；大同次之（22.2%），为2 份；朔州和太原最少，均为1 份（11.1%）。其中，70 号和71 号聚在一起，均来自忻州市。

图2 80 份糜黍核心种质资源聚类Fig.2 Cluster diagram of 80 core germplasm resources of broomcorn millet

2.4 基于SSR 的糜黍资源主成分分析

基于16 对SSR 引物对80 份糜黍资源进行主成分分析（PCA），结果如图3 所示，前3 个主成分PC1（Dim-1）、PC2（Dim-2）和PC3（Dim-3）分别解释总方差的29.12%、4.06%和3.04%，共解释累积方差的36.22%。80 份糜黍材料划归10 个类群（G1～G10），其中，G1 共13 份材料，全部来自大同；G2 共11 份材料，全部来自朔州；G3 共24 份材料，全部来自忻州；G4 共4 份材料，全部来自太原。

图3 基于SSR 的80 份糜黍资源主成分分析Fig.3 Principal component analysis of 80 broomcorn millet resources based on SSR

2.5 糜黍资源DNA 分子身份证的构建

基于SSR 的80 份糜黍资源的二维码DNA 分子身份证如图4 所示。

图4 基于SSR 的80 份糜黍资源的二维码DNA 分子身份证Fig.4 DNA molecular identity cards of 80 broomcorn millet resources based on SSR

由图4 可知，用21 对SSR 引物扩增80 份糜黍资源，利用ID Analysis 4.0 软件分析，发现16 个标记（RYW62、RYW67、RYW56、RYW65、RYW61、RYW40、RYW37、RYW31、RYW82、RYW29、RYW28、RYW49、RYW39、RYW54、RYW18 和RYW30）组合在一起可区分全部材料。如，材料1的字符串DNA 分子身份证为1100111111010111，显示扩增条带情况为：引物RYW62 有，RYW67 有，RYW56 无，RYW65 无，依次类推直到RYW30 有。将以上数据输入条形码生成器，即可得到条形码DNA 分子身份证。整合上述字符串、条形码DNA分子身份证和材料的基本信息（名称、统一编号、来源地、材料类别），输入二维码在线生成器获得二维码DNA 分子身份证。

3 结论与讨论

3.1 基于SSR 的糜黍资源的遗传多样性衡量参数

遗传多样性评估参数是衡量植物资源遗传差异的重要指标。就糜黍资源的Shannon 多样性指数（I）值和多态性信息含量（PIC）值而言，王宇卓等[22]用85 个SSR 扩增272 份山西核心种质，发现I 值和PIC 值分别为1.055 2 和0.692 1；陈小红等[21]基于35 个SSR 扩增来源于4 个生态栽培区的130 份材料，发现I 值和PIC 值分别为1.047 2 和0.696 6；本研究用44 个SSR 检测80 份山西材料，发现I 值和PIC 值分别为1.016 1 和0.660 4，与上述研究结果基本相符。

杂合度反映的是群体内遗传变异程度，观测杂合度值越接近期望杂合度值说明该群体受外来因素的影响越小，更倾向于处于遗传平衡状态。就糜黍资源的观测杂合度（Ho）和期望杂合度（He）而言，王舒婷等[28]用27 个SSR 分析57 份山西材料，发现Ho 值和He 值基本一致（分别为0.500 4 和0.496 4）；连帅等[29]用63 个SSR 检测192 份世界材料，分别为0.611 3 和0.388 7；陈小红等[21]用35 个SSR 扩增130 份中国资源，发现Ho 值和He 值分别为0.716 8和0.638 6；王宇卓等[22]用85 个SSR 鉴定272 份山西材料，发现Ho值和He值分别为0.741 9和0.641 5。本研究检测结果发现，Ho 值和He 值分别为0.243 6和0.625 2，与上述研究结果存在较大差异，这可能与试验材料地理来源差异以及试验材料的数量有关。

3.2 常规SSR 和荧光标记SSR 检测方法的比较

目前，检测物种资源间的遗传差异常用2 种方法，一是基于SSR 的聚丙烯酰胺凝胶电泳法，二是基于荧光SSR 的荧光毛细管电泳法。杨文娟等[30]用2 种方法评估芝麻种质的遗传差异，结果发现，如果检测标记的扩增条带清晰、多态性条带数目少且条带间分子量存在较大差异，则上述2 种检测结果基本一致，如标记ZMM2818 和ZMM1851 片段大小分别为260～278、268～284 bp，用2 种方法均检测到7 个多态性位点，且一一对应；标记ZMM1935和ZMM1494，用2 种方法均分别检测到6、12 个多态性位点，但聚丙烯酰胺凝胶电泳条带模糊；引物ZMM2254 和ZMM3037，用2 种方法均检测到多态性位点数目不同，前者分别为4、5 个，后者分别为6、8 个。连灵燕等[31]以全球第三大粮食作物玉米的20 个自交系为材料，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳用21 个SSR 构建了的指纹图谱。鉴别水稻和玉米DNA 指纹图谱，当分析材料较少时，聚丙烯酰胺凝胶电泳法比荧光毛细管电泳法经济有效，一方面不需要昂贵的测试仪器；另一方面，试剂便宜，且常规引物不仅合成价格低，而且保存期长达4 a[32]。靳玲兵等[33]以经济树种核桃为材料，用上述2 种方法评估多态性，发现荧光标记用的数量多则合成成本太高，限制实际应用，因此，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳先行对SSR引物进行初步筛选。在糜黍方面，王宇卓等[22]和陈小红等[21]基于常规SSR 分别检测了山西资源和中国资源的遗传差异；林元香[34]则比较了2 种方法的差异，发现荧光SSR 检测仅用7 个标记，是普通SSR 检测（20 个标记）效率的3 倍。

3.3 字符串DNA 分子身份证在植物鉴定中的运用

在作物DNA 分子身份证的构建过程中，SSR引物的筛选是关键环节[35]。通常，就物种遗传差异的衡量指标而言，Na 值、I 值和PIC 值越高，检测引物在品种鉴定中的灵敏度越高。但本研究结果表明，单纯按照某指标的高低排序对引物进行组合，难以获得最优核心引物组合，而使用相关排列组合软件则选择效果好。本研究在引物的初步筛选中，多态性较高、位列前3 的为RYW67、RYW18 和RYW61，但它们分别排在第39、10、35 位。作物种质资源的DNA 分子身份证与材料的地理来源密切相关，地理来源接近，分子身份证类似；地理来源存在较大差异，则分子身份证容易识别[21]。陈昌文等[12]以果树资源桃树为材料，构建了中国品种的DNA分子身份证，其中来源于吉林的吉林8501 和吉林8601 分子身份证432566620382554 和43257661038 55545 类似，前4 位数字完全一致；而来源于新疆的喀什3 号和陕西的陕甘山桃分子身份证436756614 3957525 和1502233222010434 差异明显，很容易识别。就糜黍资源而言，DNA 分子身份证的构建研究不多，陈小红等[21]基于35 个高基元SSR 构建了来源于4 个生态栽培区的130 份材料的字符串DNA 分子身份证，其中，山西省阳泉市黑黍子（编号19）和红黍子（编号30）分别为00110101001100001和00110010011100111，较为相似；而陕西省安康市的糯糜子（00004821）和内蒙古双耳糜（00007276）分别为11110101111010111 和1010001000100101，差异明显。王宇卓等[22]基于20 个高基元SSR 构建了272 份山西材料的字符串DNA 分子身份证，发现阳泉市平定县的大白黍（序号35）和红黍子（序号37）分别为10011111101001111011和100101011110 01111011，较为相近；而大同市灵丘县的大青黍（序号8）和阳泉市平定县的红黍子（序号23）分别为00100111000011001010 和11111101111111111111，差异较大。本试验也得到类似结果，大同市天镇县的白疙垛和紫龙带分子身份证0010100101001111和0010110110010011，前5 位字符完全一致，不易识别；而忻州市偏关县的灰脸蛋黍和运城市闻喜县的白软黍分子身份证分别为0000011000111101 和1111010111100111，前4 位字符完全不同，易于分辨。

本研究以80 份山西糜黍种质资源为试验材料，基于用最少引物区分最多材料的原则，用16 个SSR 构建了全部材料的二维码DNA 分子身份证，为糜黍育种亲本的选配提供了本底信息，同时也为糜黍资源遗传多样性检测提供了分子检测工具。