抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者血清外泌体HBV-miR-3动态变化与病毒学指标的关系

钟剑秋 徐燕 徐敏

慢性乙型肝炎(CHB)可进展为肝纤维化、肝硬化,甚至肝癌,而抗病毒治疗是控制CHB向肝硬化和肝癌发展的重要措施[1-3]。核苷(酸)类似物是CHB防治指南推荐的抗HBV的一线药物,可竞争性抑制HBV DNA聚合酶的活性,抑制HBV DNA复制,抗病毒作用强,安全性好,但早期应答率低,疗程长[4-5]。研究发现,HBV可编码HBV相关microRNA,其被命名为HBV-miR-3,可作为HBV 共价闭合环状DNA(cccDNA)检测的替代标志物[6]。本研究探讨CHB患者抗病毒治疗前后血清外泌体HBV-miR-3动态变化与病毒学指标的关系,分析HBV-miR-3是否可用于预测抗病毒疗效。

资料与方法

一、一般资料

选取2020年6月至2021年6月收治的116例CHB患者,均接受替诺福韦(TDF,福建广生堂药业股份有限公司)治疗,300 mg/次,1次/d,随餐服用,共12个月。

纳入标准:CHB诊断符合文献[7]标准;年龄>18岁;接受TDF单药初治12个月。排除标准:其他嗜肝性病毒感染;合并其他慢性肝病;已出现明显肝纤维化、肝硬化或者肝癌;合并其他严重肝脏疾病、内科疾病或者恶性肿瘤。

二、监测指标

一般资料包括性别和年龄。治疗前及治疗后3、6、9和12个月,采集静脉血10 mL,采用全自动生化分析仪检测ALT;电化学发光法(ARCHITECTi2000检测仪)检测HBsAg定量;PCR检测HBV DNA。

三、外泌体HBV-miR-3检测

采用干燥管留取全血2 mL,以1500 r/min离心5 min,取上清液,转移至1.50mL离心管备用。按外泌体提取试剂盒(上海贝博生物科技公司)说明提取血清外泌体,采用Trizol试剂(上海贝博生物科技公司)提取总RNA,参照反转录试剂盒(上海贝博生物科技公司)说明将总RNA反转录为cDNA,荧光定量PCR试剂盒(上海贝博生物科技公司)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,以miR-21作为内参,RT-PCR引 物:miR-3:5′-CGCGAGCACAGAATTA-ATACGACTCACTATACGCGAAACGCCGCA-3′,下游引物 5′-CGCGAGCACAGAATTAATACG-3′,miR-21:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG-GTATTCGCACTGGATACGACTCAACA-3′。采用qRT-PCR进行全定量检测:miR-3引物序列:上 游 引 物5′-TGTGCCCGCTGGATCTGTC-3′,下游引物 5′-CGCGAGCACAGAATTAATACG-3′,Taqman探针:FAM-CTCACTATACGCGAAACG-MGB;miR-21引物序列:上游引物 5′-GCCCGCTAGCTTATC-AGACTGATG-3′,下游引物 5′-GTGCAGGGTC-CGAGGT-3′,Taqman探针:FAM-CTGGATACG-ACTCAACA-MGB。采用罗氏 LightCycler480 II 实时荧光定量PCR分析荧光信号并检测绝对定量。

四、统计学分析

使用SPSS 25.0软件进行统计分析。根据资料类型进行t检验或卡方检验;Pearson相关分析外泌体HBV-miR-3水平与病毒学指标的关系;受试者工作特征曲线分析外泌体HBV-miR-3水平对病毒学应答的预测效能。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、VR+组和VR-组一般资料比较

抗病毒治疗12个月后,发生病毒学应答(VR+组)54例(46.55%),未发生病毒学应答(VR-组)62例。VR+组和VR-组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05),VR+组ALT水平高于VR-组,而HBsAg、HBV DNA和外泌体HBV-miR-3水平低于VR-组(P<0.05),见表1。

表1 VR+组与VR-组一般资料比较(±s)

二、VR+组和VR-组接受抗病毒治疗前后病毒学指标和外泌体HBV-miR-3的动态变化

接受抗病毒治疗后,VR+组和VR-组ALT水平均快速下降,VR+组基线ALT水平高于VR-组,治疗3个月后下降至与VR-组水平相当,且一直维持到治疗结束;VR+组HBsAg、HBV DNA和外泌体HBV-miR-3水平在抗病毒治疗后明显下降,而VR-组虽有下降但变化不明显,且一直高于VR+组(P<0.05),见表2。

表2 VR+组和VR-组接受抗病毒治疗前后病毒学指标和外泌体HBV-miR-3的动态变化(±s)

三、血清外泌体HBV-miR-3水平与病毒学指标的关系

血清外泌体HBV-miR-3水平与ALT无明显相关性(r=0.049,P=0.241),与HBV DNA和HBsAg呈正相关(r=0.314、0.809,P<0.05)。

四、血清外泌体HBV-miR-3水平对病毒学应答的预测效能

治疗3个月时,外泌体HBV-miR-3以4.52 lg拷贝/mL为最佳界值的AUC最大,敏感度和特异度最高,见表3。

表3 抗病毒治疗各时间点外泌体HBV-miR-3水平对病毒学应答的预测效能

讨 论

感染HBV后,体内HBV经肝细胞膜进入细胞核,并以cccDNA作为HBV复制的模板,其具有半衰期长、可自我补充的特点,且难以彻底将HBV从体内清除,目前尚缺乏简单易行的cccDNA定量检测方法[8]。HBV感染会引起机体的免疫应答反应,造成肝细胞损伤及炎症坏死,且炎症坏死的持续存在可增加CHB患者肝硬化、肝癌的发生风险。数据显示,未抗病毒治疗的CHB肝硬化年发生率达2%～6%,而肝硬化患者肝癌的年发生率亦达3%～6%[9,10]。据报道TDF存在早期应答率低的问题[11]。HBV DNA是判断抗病毒治疗应答最常用的指标,但其下降仅代表HBV复制减少;而ALT、HBsAg、HBeAg、乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)和HBV前基因组RNA(pgRNA)等尚不能准确反映机体对HBV的免疫控制程度,也无法代替肝组织cccDNA检测[12,13]。

HBV-miR-3主要由感染了HBV的肝细胞分泌,与肝炎恢复期相比,HBV-miR-3相对定量在肝炎活动期异常升高[14]。本研究结果显示,VR+组HBV-miR-3水平低于VR-组,且CHB患者接受抗病毒治疗后,VR+组HBV-miR-3水平随疗程的延长而逐渐降低,提示基线HBV-miR-3水平较低的CHB患者更可能在抗病毒治疗后达到病毒学应答的目标,动态检测HBV-miR-3水平可辅助判断治疗的应答情况,指导后续治疗。

研究证实,HBV-miR-3水平能够在一定程度上作为HBV cccDNA检测的替代标志物,且与血清HBV DNA水平存在正相关[15]。本研究显示,VR+组HBsAg、HBV DNA和外泌体HBV-miR-3水平在接受抗病毒治疗后明显下降,且HBV-miR-3水平与HBV DNA和HBsAg呈正相关。原因可能是:以cccDNA为模板能够合成3.5、2.4、2.1 kb mRNA,进一步以mRNA为模板合成HBV-miR,因此HBV-miR-3能够一定程度上代表cccDNA的数量,而随着抗病毒治疗,HBV DNA复制被抑制,cccDNA逐渐从肝细胞中清除,故HBV-miR-3水平逐渐下降,而HBV DNA和HBsAg亦逐渐降低,因此HBV-miR-3与二者间存在显著正相关性。此外,治疗3个月时,外泌体HBV-miR-3以4.52 lg拷贝/mL为最佳界值的AUC最大,敏感度和特异度最高。提示HBV-miR-3水平可早期预测抗病毒治疗的效果。

综上所述,CHB患者血清外泌体HBV-miR-3水平随着抗病毒治疗时间的延长而下降,与病毒学指标HBV DNA和HBsAg呈正相关,且抗病毒治疗3个月时HBV-miR-3的临界值可作为预测CHB患者抗病毒治疗12个月的病毒学应答的指标。但鉴于本研究样本量较少,且未进行长时间的随访,今后仍需扩大样本和延长观察时间进一步验证。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。