芒果中农药残留胶体金免疫层析快速检测方法的建立与应用

韦 盈，李 川，符郁馥，林志藩，郭晓宇，康 蕊*

（1.海南省食品检验检测中心，海南海口 570314；2.国家市场监管重点实验室（热带果蔬质量与安全），海南海口 570314；3.海南大学 食品科学与工程学院，海南海口 570228）

芒果，系多年生热带、亚热带水果，是仅次于香蕉的世界第二大热带水果[1]。芒果果实含有丰富的糖、维生素、蛋白质、粗纤维和微量元素，其果肉细腻可口，营养物质丰富，深受人们喜爱[2]。我国芒果主要产区分布于海南、广西、云南、广东、四川、福建和台湾等省区[3-4]。目前芒果产业已经成为我国热带和亚热带地区支柱产业之一，在推进农业结构优化调整、农民增收、扩大出口和满足人们的生活需求等方面发挥着重要作用。

果蔬中农药残留超标是消费者最关注的食品安全问题。马晨等[5]对海南芒果中农药残留情况进行了分析，发现芒果中不合格率较高的农药残留分别是吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺，不合格率分别为21.91%、19.1%、2.81%。目前农药的检测方法主要是实验室仪器法，该方法不仅需要高精端仪器和专业人员，而且操作复杂，检测时间长，很难控制在销售期内完成检验，无法有效保证食品安全。因此，利用快速检测技术对市场上芒果进行农药残留检测很有必要。

农药残留常见的快速检测方法是酶抑制率法和拉曼光谱法。酶抑制率法主要用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药，由于酶易受色素、植物次生物质影响，其适用的种类有限，准确度也不够高[6]。拉曼光谱法因需要建立数据库，且选择的基底有限，不能被广泛应用。胶体金免疫层析技术是一种以胶体金作为示踪标志物，抗原抗体特异性竞争的新型检测技术。由于其具备快速、操作简单、成本低、无需贵重设备等优点，被广泛应用于各检测领域。随着各种农药抗体的成功制备，近几年该技术越来越多地被运用到农药残留检测中[7]。胶体金免疫层析技术与酶抑制率法相比，具有灵敏度高、抗干扰能力强等特点，可用于单一种类农药残留的检测分析。

吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉是芒果中风险较高的项目，目前没有同时检测这几种农药残留的快速检测方法，芒果基质的适用性也缺少相应研究。本研究旨在对胶体金免疫层析法同时检测芒果中吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺的快速检测技术开展应用研究，以期为芒果质量安全监管和生产者安全自检工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芒果来源于海南省海口市、东方市、昌江县果园、农贸市场和超市；吡唑醚菌酯残留检测试纸条、噻虫胺残留检测试纸条、吡虫啉残留检测试纸条和提取液，中检国研（北京）科技有限公司；柠檬酸钠二水合物、柠檬酸钠二钠盐倍半水合物、氯化钠和无水硫酸镁（分析纯），广州化学试剂厂；甲酸（色谱级），甲醇、乙腈（质谱级），默克公司；实验室用水由miili-Q A10超纯水机制备。

对照品：吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉、苯醚甲环唑、灭蝇胺、啶虫脒、丙溴磷、毒死蜱和克百威，纯度为99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与设备

TQ-S超高效液相-质谱串联仪，美国沃特世公司；XS205、XS204分析天平，美国梅特勒公司；Centrifuge 5804离心机，德国艾本德股份公司；MS3微量振荡器，德国IKA公司；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液枪，德国BRAND公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验原理

本方法采用胶体金免疫层析原理。样品中的吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉等农药经提取后与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和试纸条中检测线（T线）上抗原的结合，从而产生检测线颜色深浅的变化[8]。通过比较检测线（T线）与控制线（C线）颜色变化，对样品中吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉进行定性判定。

1.3.2 实验方法

取新鲜芒果擦去泥土，剪碎成小于1 cm见方的碎片。称取（2.00±0.05）g样品至15 mL离心管中，再加入5 mL提取液，盖上盖子，涡旋仪涡动或手动上下振荡1 min，静置2 min，得样品液。从原包装袋中取出试纸条。用一次性微型吸管吸取样品提取液，垂直缓慢滴加3滴（约100 μL）于加样孔（S孔）中。滴加后立即计时，10 min后，判定结果。

1.3.3 结果判定

本方法采用目测方式，通过比较检测线（T线）与控制线（C线）颜色，定性判定样品中是否含有待测物。如图1所示，T线与C线显色相同或T线显色深于C线，表示样品中未检出待测物或待测物浓度低于检测限，判为阴性（-）；T线显色浅于C线，或者T线消失，表示样品中有待测物检出，判为阳性（+）；C线不显色，表示试纸条已失效或前处理操作不正确，判为无效[8]。

图1 结果判定示意图（比色法）

1.3.4 评价方法

每个项目取芒果空白基质60份，设置空白样品、检出限1倍、检出限2倍3个浓度水平，每个浓度水平20例进行验证评价，对建立的快速检测方法进行灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率以及与参比方法一致性的分析，评价方法的灵敏度和准确度。

1.3.5 交叉反应实验

取芒果空白样品18份，分为3组，使用苯醚甲环唑、丙溴磷、灭蝇胺、毒死蜱、啶虫脒和克百威有证标准物质进行加标，使每组每个样品的干扰物浓度分别为5 mg·kg-1，吡唑醚菌酯残留检测试纸条、噻虫胺残留检测试纸条、吡虫啉残留检测试纸条各测试一组样品。

2 结果与分析

2.1 制样方式优化

取新鲜芒果分成2份，一份剪碎成小于1 cm见方的碎片，另一份用组织捣碎机匀浆，称取2 g样品进行实验。制样方式不同，胶体金卡呈现的显色效果不同。芒果被均质后样品内容物释放，对显色造成一定的干扰，不利于结果的判定，且试验过程中容易堵塞加样孔。故本研究采用剪碎成小于1 cm见方的碎片为制样方式。

2.2 提取时间优化

设置提取时间为1 min、2 min、5 min、10 min、30 min、60 min和120 min，称取2 g样品进行实验。结果表明，提取时间对阴性样品几乎无影响；对于阳性样品，提取时间为1 min、2 min、5 min、10 min和30 min时，目标物均可被很好地提取，30 min后随着提取时间增加，受环境影响目标物有所降解，阳性变弱。综合考虑样品提取时间以2～5 min为最佳，超过30 min未测定应重新取样进行处理。

2.3 免疫反应时间优化

设置免疫反应时间为1 min、2 min、5 min、8 min、10 min、15 min和30 min，称取2 g样品进行实验。免疫反应2 min时，样品可从样品孔沿NC膜（硝酸纤维素膜）层析至试纸条顶端，此时T线、C线初步显色，但显色不明显；2～5 min时，T线、C线继续增强，5 min时可以判读结果；5～8 min时，T线、C线显色继续增强，变化速度有所减慢；8～10 min时，T线、C线颜色不再增强。综合考虑，免疫反应时间以10 min为最佳。

2.4 检出限

《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）中规定吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺在芒果中的最大残留限量分别为0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，故本快检方法设置吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺检出限分别为0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1。取芒果基质空白试样，分别添加一系列吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺标准溶液，并进行测定。结果显示，在未稀释的情况下吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺检出浓度水平分别为0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1、0.005 mg·kg-1，与设置的检出限0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1相比，吡唑醚菌酯无需稀释，可直接测定；吡虫啉、噻虫胺试纸条较灵敏，需稀释后测定，稀释倍数分别为2和8。

2.5 评价结果

根据样品制备信息和快筛检测结果，3个项目评价结果如下。①吡虫啉、噻虫胺两个项目假阴性率、假阳性率均为0%，灵敏度、特异性、相对准确度均为100%，表明该方法在设置的检出限处检得出、检得准。②吡唑醚菌酯40个阳性样品中被检出2个阴性结果，且2个阴性结果均出现在1倍检出限样品中，其灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率、相对准确度分别为95%、100%、5%、0%、96.7%，说明吡唑醚菌酯与吡虫啉、噻虫胺相比灵敏度还需进一步提高。③3个项目均满足灵敏度≥95%、特异性≥85%、假阴性率≤5%、假阳性率≤15%的要求，建立的快速检测方法具有一定的可行性。

2.6 交叉实验

使用本方法检测含有5 mg·kg-1苯醚甲环唑、丙溴磷、灭蝇胺、毒死蜱、啶虫脒和克百威的样品，结果如表1。吡唑醚菌酯检测试纸条、吡虫啉检测试纸条、噻虫胺检测试纸条对其他农药均呈现阴性，方法特异性好。

表1 交叉反应实验结果

2.7 样品测试及一致性分析

从市场上采集40份芒果样品，同时按照参比方法《食品安全国家标准 植物性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》（GB 23200.121—2021）和本研究所建立的快检方法对样品进行测试，比对数据见表2。胶体金试纸条检出噻虫胺4批阳性，分别为澳芒1批次、贵妃芒2批次、苹果芒1批次；吡唑醚菌酯1批次阳性，为鸡蛋芒；吡虫啉未检出阳性。胶体金试纸条检测结果与参比方法检测结果符合率为100%，建立的快检方法准确度较高。

3 结论

本研究基于胶体金免疫层析技术原理，针对芒果中风险较高的吡唑醚菌酯、噻虫胺、吡虫啉3种农药残留建立了一种同时检测的快速检测方法。该方法吡唑醚菌酯、吡虫啉、噻虫胺检出限分别为0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，符合国家标准的要求，且操作简单，准确度高，成本低，适合缺乏实验条件的农贸市场、进出口港口对大量样本进行快速筛查，大大提高芒果的检测效率以及发现问题的能力，为食品安全的科学监管提供了有力的技术支撑。