微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度评定

高利海，陈秋明，钟燕华

（精益和泰质量检测股份有限公司，广东广州 510700）

叶酸是一种水溶性维生素，又名蝶酰谷氨酸，在自然界主要以蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸3种成分结合成母体化合物而存在[1]。叶酸在蛋白质合成及细胞分裂与生长过程中具有重要作用，缺少时会造成红细胞中血红蛋白减少、细胞发育停滞，出现巨幼红细胞性贫血疾病[2]。

目前，用来检测食品中叶酸含量的常用方法有仪器法（如高效液相色谱法）、试剂盒法（酶联免疫吸附法）和微生物法等[3-5]。其中，微生物法是国内外普遍采用的检测方法，也是我国食品安全国家标准推荐检测方法，但微生物生长影响因素较多，检测方法操作烦琐，容易造成结果偏差。因此，为提高试验检测结果的准确性与可靠性，本文依据RB/T 151—2016及GB 5009.211—2022等标准评估了微生物法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度分量，进而对其进行合成与扩展，用来表征叶酸真值含量范围。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

CPA225D电子天平（精度0.1 mg）、QUINTIX513-1CN电子天平（精度0.01 mg）来源于赛多利斯；GNP-9270恒温培养箱来源于精宏；Cary60紫外可见分光光度计来源于安捷伦。

1.3 方法

按《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》（GB 5009.211—2022）规定的方法检测婴幼儿配方乳粉中叶酸含量。

2 结果与分析

2.1 不确定度分量来源

根据《测量不确定度的要求》（CNASCL01-G003:2021）、《食品微生物定量检测的测量不确定度评估指南》（RB/T 151—2016）等文件评定不确定度，确定影响检测结果的主要因素包含重复性测量、标准品称量、标准溶液配制及系列管制备、试样称量、试样溶液配制及系列管制备、仪器偏差及标准曲线拟合等几个方面。

2.2 各影响因素的相对标准不确定度评定

2.2.1 重复性测量

按照国标方法对婴幼儿配方乳粉中叶酸含量进行6次平行测定，重复性测量产生的标准不确定度属于A类不确定度。重复性测定结果见表1。

表1 重复性测定结果

根据贝塞尔公式计算标准差为

晞月眼眸如波，朝着青樱浅浅一漾，温柔的眼眸中闪过一丝不驯，她柔声细语：“妹妹与我都是侧福晋，我怎敢不随侍在主子娘娘身边？”她顿一顿，“而且，主子娘娘醒来，未必喜欢看见妹妹。”

同一个样品重复进行2次测定，结果取平均值，计算标准不确定度为

则相对标准不确定度为

2.2.2 标准品称量

根据使用的电子天平（精度为0.01 mg）的检定证书可知，当0.01 mg≤m≤5 g时，允差为±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子为计算标准不确定度为

试验使用减重法称取20.0 mg叶酸标准品，称重2次，1次为去皮空盘质量，1次为总质量，计算标准不确定度为=0.409mg，则相对标准不确定度为urel(m标)=0.409/20=0.020 5。

2.2.3 标准溶液配制

根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）、《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允许误差，结合使用次数与器具容量，计算各器具的相对标准不确定度（假设矩形分布，包含因子为），结果见表2，则标准溶液配制的相对标准不确定度为

表2 标准溶液配制引入的各相对标准不确定度

2.2.4 标准系列管制备

根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允许误差，结合吸取溶液体积，计算各器具的相对标准不确定度（假设矩形分布，包含因子为），结果见表3，则标准系列管的相对标准不确定度为

表3 标准系列管制备引入的各相对标准不确定度

合成上述2.2.2、2.2.3、2.2.4各因素引入的相对标准不确定度为

2.2.5 试样称量

根据使用的电子天平（精度为0.001 mg）的检定证书可知，当0.02 g≤m≤50 g时，允差为±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子为计算标准不确定度为

试验使用减重法称取0.500 g试样，称重2次，1次为去皮空盘质量，1次为总质量，则标准不确定度为=0.409mg，则相对标准不确定度为urel(m样)=0.409/500=0.000 818。

2.2.6 试样溶液配制

根据《移液器检定规程》（JJG646—2006）、《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允许误差，结合使用次数与器具容量，计算各器具的相对标准不确定度（假设矩形分布，包含因子为），结果见表4，则试样溶液配制的相对标准不确定度为

表4 试样溶液配制引入的各相对标准不确定度

2.2.7 试样系列管制备

根据《移液器检定规程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允许误差，结合移液器吸取体积，计算相对标准不确定度（假设矩形分布，包含因子为），结果见表5，则试样系列管制备的相对标准不确定度为

表5 试样系列管制备引入的各相对标准不确定度

合成上述2.2.5、2.2.6、2.2.7各因素引入的相对标准不确定度为

2.2.8 标准曲线拟合

标准曲线线性回归方程y=0.679 8x+0.255 9，截距a=0.255 9，斜率b=0.679 8。测定次数为27，测试点数据见表6，则残差的标准差为

各标准溶液浓度的离均差平方和为

式中：Ci为各标准溶液叶酸含量，ng；为各标准溶液叶酸含量平均值，为0.439 ng。

按照GB 5009.211—2022，试样系列管中分别加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL试样稀释液，每个梯度做3个平行，即测定9次，测得吸光值，叶酸含量见表7。

表7 试样管叶酸含量

计算标准曲线拟合引入的标准不确定度为

标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为

2.2.9 紫外可见分光光度计

根据仪器校准证书可知，包含因子k=2，置信概率95%，扩展不确定度为0.2%，则计算其相对标准不确定度urel(S5)=0.002/2=0.001。

2.3 各影响因素的相对标准不确定度合成、扩展及表示

2.3.1 各影响因素的相对标准不确定度分量合成、扩展

各影响因素的相对标准不确定度如表8所示，则合成相对标准不确定度为

表8 各影响因素的相对标准不确定度分量

当包含因子k=2，置信概率95%，计算其相对扩展不确定度Urel=0.039×2=0.078 6。

2.3.2 测量不确定度表示

按照标准规定方法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量，均值为66.1 μg/100 g，扩展不确定度为U95=0.078 6×66.1 μg/100 g=5.2 μg/100 g，包含因子k=2，置信概率95%。

3 结论

通过分析和评估测定婴幼儿配方乳粉中叶酸含量的不确定度分量可知，影响较大的因素是重复性测量、标准溶液配制、标准曲线拟合，其中标准溶液配制影响较大是标准品称量与标准系列管制备，相对标准不确定度分别为0.020 5和0.017 6，标准曲线拟合相对标准不确定度为0.023。因此试验过程中要严格按照标准规定，规范实验操作流程，加强人员培训，从而获得更好重复性，同时尽量使用高精密度电子天平称量标准品，购买正规厂家玻璃器皿，定期计量和维护，对检测仪器要定期校准，以确保检验结果的准确性。