45份青海春小麦品种矮秆基因检测及效应分析

马德林,邢 瑜,郭仁世,王成林,张业猛

(1.青海省农作物种子站,青海西宁 810003; 2.海西州农业技术综合服务中心,青海德令哈 817000; 3.中国科学院大学,北京 100039)

小麦(TriticumaestivumL.)株高是由遗传因子和外部环境共同影响,降低株高可提升小麦的抗倒伏能力和收获指数[1-2]。在一定范围内小麦株高与产量呈正相关,但过度矮化则会降低产量[3-4]。合理利用矮秆基因,深入分析其遗传效应,有利于促进矮秆基因的多元利用,实现小麦增产。

自1999年Peng等[5]发现并克隆了矮秆基因Rht-B1b(Rht1)和Rht-D1b(Rht2)后,目前已鉴定出26个小麦矮秆基因。分子标记辅助选择技术可加速小麦育种进程,已广泛应用于多种作物育种中[6]。Ellis等[7-8]不仅设计出可以精确检测Rht-B1b和Rht-D1b基因的STS引物,也开发出与Rht4、Rht5、Rht8等矮秆基因紧密连锁的分子标记。利用这些特异性分子标记,李怡鑫等[9]发现47份外引小麦种质资源中,有46份含有矮秆基因,其中Rht-B1b、Rht4和Rht12的分布频率较高;孙树贵等[10]发现67份美国小麦品种中,有56份品种含有矮秆基因,其中Rht-B1b和Rht8的分布频率分别是62.7%和43.3%;陈向东等[11]发现中国小麦主产区的117份种质资源中,矮秆基因的分布频率为Rht8>Rht-B1b>Rht-D1b>Rht9>Rht13。

竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele-specific PCR,KASP)针对基因组DNA样本,可以快速、准确判断SNP和InDel,已被广泛应用于小麦功能基因检测和分子标记辅助育种[12]。为了解青海春麦区小麦品种中Rht-B1b和Rht-D1b基因的类型及分布特点,本研究利用Ramirez-gonzalea等[13]报道的小麦KASP引物,对青海春麦区历年种植的45份小麦品种(6份地方品种、14份外引品种、25份育成品种)的矮秆基因变异类型进行检测,为青海省小麦矮秆育种提供技术支撑和材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试45份小麦品种均系本实验室自繁保留,审定信息来自《青海省农作物品种志》和中国种业大数据平台(http://202.127.42.145/bigdataNew/home/ManageOrg),详细信息见表1。

表1 供试小麦品种信息Table 1 Information of the tested wheat varieties

1.2 田间种植及农艺性状测定

田间试验于2013-2015年在青海省海西蒙古族藏族自治州香日德镇(36°3′52″ N,97°47′45″ E,海拔 2 999 m)进行,每个品种种植5行,行长2 m,行距0.2 m,每行播种50粒种子,田间管理同大田生产。参照《农作物品种区域试验技术规程:小麦》(NY/T 1301-2007)对株高、穗长、小穗数和穗粒数进行测定。

1.3 DNA提取及KASP标记检测

于2015年,每份材料采集3株小麦的幼嫩叶片,混合后采用CTAB法提取基因组DNA,使用美国(Thermo)公司微量紫外分光光度计(Nano Drop 2000C)进行DNA浓度和质量测定。检测Rht-B1和Rht-D1不同等位变异的KASP引物由北京佩莱技术有限公司合成,引物序列见表2。FAM-primer 5′末端连接1个FAM荧光基团(5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′),HEX-primer 5′末端连接1个HEX荧光基团(5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′)。利用Bio-Rad CFX96 PCR仪(Bio-Rad,美国)进行PCR扩增。PCR反应体系为10 μL,包括4.78 μL DNA(5～50 ng·μL-1),5 μL KASP 5000 V4.02×Master Mix,0.14 μL KASP Assay Mix(上、下游引物混合液),0.08 μL Mg2+。PCR反应程序为降落PCR,具体为:94 ℃ 15 min;94 ℃ 20 s,61～55 ℃ 1 min(每个循环下降0.6 ℃),10个循环;94 ℃ 20 s,55 ℃ 1 min,30个循环;4 ℃避光保存。

表2 本研究所用的KASP引物Table 2 KASP primers used in this study

1.4 数据统计

采用SPSS 23.0软件进行数据分析,对携带不同等位变异小麦品种的株高、穗长、小穗数和穗粒数表型进行差异显著性分析和方差分析(ANOVA),并利用LSD法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 株高、穗长、小穗数和穗粒数表型分析

2013-2015年,45个小麦品种的株高平均值分别为100.21、89.21和103.59 cm,变化范围分别为72.90～131.07、65.33～125.00和70.00～134.17 cm,变异系数分别为15.08%、16.12%和16.05%;穗长平均值分别为8.55、8.91和9.40 cm,变化范围分别为4.22～14.09、4.40～16.84和4.69～15.85 cm,变异系数分别为18.71%、22.22%和18.94%;小穗数平均值分别为17.67、16.61和17.59,变化范围分别为14.00～21.37、13.45～21.34和14.67～21.70,变异系数分别为10.13%、10.05%和9.49%;穗粒数平均值分别为39.49、47.30和49.65,变化范围分别为22.07～56.60、31.75～64.08和34.47～60.27,变异系数分别为20.79%、16.33%和14.36%(表3)。这些结果表明,供试45份小麦品种的株高、穗长、小穗数和穗粒数的遗传变异丰富,具有较大的改良潜力。进一步对不同来源品种的株高、穗长、小穗数和穗粒数表型进行分析,发现青海育成品种的穗粒数显著高于引进品种和地方品种;小穗数显著高于引进品种,而与地方品种间无显著差异;株高和穗长与引进品种间无显著差异,且两个来源品种的株高均显著低于地方品种,穗长均显著高于地方品种(表4)。

表3 2013-2015年小麦品种的农艺性状表型分析Table 3 Phenotypic analysis of agronomic characters of wheat varieties in 2013-2015

表4 不用来源小麦品种的农艺性状表型分析Table 4 Phenotypic analysis of agronomic traits of wheat varieties from different origins

2.2 矮秆基因不同等位变异的分布及其对农艺性状的影响

供试45个小麦品种中,Rht-B1位点上存在Rht-B1a和Rht-B1b两种等位变异,分布频率分别为91.11%和8.89%。携带Rht-B1b的品种株高显著低于携带Rht-B1a的品种,而穗粒数则相反;携带两种等位变异品种的穗长和小穗数无显著差异。Rht-D1位点上存在Rht-D1a和Rht-D1b两种等位变异,分布频率分别为86.67%和13.33%。携带Rht-D1b的品种株高和穗粒数显著低于携带Rht-D1a的品种,而穗长则相反;携带两种等位变异品种的小穗数无显著差异(表5)。进一步对不同来源品种中矮秆优异等位变异Rht-B1b和Rht-D1b的分布频率进行分析,发现青海育成品种中Rht-B1b和Rht-D1b的分布频率分别为16.00%和12.00%;外引品种中只含有Rht-D1b,分布频率为21.43%;而地方品种不含有Rht-B1b和Rht-D1b(表6)。推测是由于青海地处干旱半干旱地区,春旱严重,蒸发量大,株高较高的小麦品种根系发达,抗旱性较强,在小麦地方品种选育过程中,忽略了株高方面的选育,从而导致地方品种不含有Rht-B1b和Rht-D1b;而引进品种不含有Rht-B1b的原因可能是育种家对小麦特异性状的选择,致使在育种过程中Rht-B1b逐渐丢失。

表5 矮秆基因的不同等位变异对小麦品种农艺性状的影响Table 5 Effect of different allelic variations of dwarf genes on agronomic traits of wheat varieties

表6 不同来源小麦品种Rht-B1b和Rht-D1b等位变异的分布频率Table 6 Distribution frequency of Rht-B1b和Rht-D1bof wheat varieties from different origins

2.3 不同基因型组合对小麦农艺性状的影响

供试45份小麦品种中,共发现Rht-B1a/Rht-D1a、Rht-B1a/Rht-D1b和Rht-B1b/Rht-D1a三种等位变异组合类型,分布频率分别为77.78%、13.33%和8.89%。携带Rht-B1a/Rht-D1b品种的株高显著低于携带Rht-B1a/Rht-D1a和Rht-B1b/Rht-D1a的品种,携带Rht-B1b/Rht-D1a品种的株高也显著低于携带Rht-B1a/Rht-D1a的品种。其中,Rht-B1b/Rht-D1a组合类型不仅可使株高降低,也可增加小穗数和穗粒数(表7)。

表7 不同等位变异组合对小麦农艺性状的影响Table 7 Effect ofdifferent allelic variation combinations on agronomic traits of wheat varieties

3 讨论

小麦是世界上最重要的禾谷类作物之一,约有40%的人口以其作为主要的粮食来源[14]。因此,高产、稳产是小麦育种的主要目标。株高作为小麦生产上重要的农艺性状,与小麦的形态建成以及田间群体构成密切相关,且与小麦高产和稳产具有直接的关系[3,15]。在一定程度上降低小麦株高,可充分利用耕地、增强小麦光合效率和抗倒伏能力,从而保证小麦稳产和高产[16]。矮秆基因多为隐性基因,且小麦株高易受到环境条件的影响,在育种过程中选择比较困难,因此结合分子标记检测,明确矮秆基因在小麦种质中的分布,可加快育种进程[11]。

小麦株高和产量均是由多基因控制的综合性状, 仅依靠单个基因进行分子辅助育种很难达到提升小麦产量的目的,需要结合传统表型选育杂交技术,将多个优势基因聚合,从而实现多基因聚合育种,全面提升小麦产量。本研究采用KASP标记对青海春麦区45份小麦资源进行矮秆基因检测,未发现同时含有Rht-B1b和Rht-D1b矮秆基因的品种,该结果与徐晶晶等[2]的研究结果一致。但我国其他麦区对Rht-B1b和Rht-D1b的利用率明显高于青海育成品种[17]。徐 晴等[18]检测了来自中国不同麦区的211份小麦资源,发现Rht-B1b和Rht-D1b的分布频率分别为38.39%和47.39%;而西北春麦区这两个基因的分布频率仅分别为7.14%和14.29%。值得注意的是,Rht-D1b的利用会降低穗粒数,原因可能是Rht-D1b的降秆效应较大,使胚芽鞘长度降低,影响幼苗生长势和群体密度,最终导致产量下降[19]。这也是本研究供试材料中未发现Rht-B1b/Rht-D1b等位变异组合类型的原因。

矮秆基因是小麦育种过程中重要的基因资源之一,明确小麦资源中矮秆基因的分布,能有效促进矮秆基因的利用,拓宽矮秆基因遗传基础。本研究分析了青海春麦区部分骨干品种中Rht-B1b和Rht-D1b的分布,分别筛选出含有Rht-B1b和Rht-D1b的小麦品种4份(青海育成品种)和6份(3个青海地区育成和3个引进品种),为矮秆高产小麦品种的选育提供了新的材料。