丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物基于TGF-β1抑制人皮肤成纤维细胞的研究

辛林林 王浩南 张喆 白艳红 刘红燕 周颖 李庆军 刘谦 张永清

[摘要]目的：研究丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblasts，HSF）抑制瘢痕形成的影响及分子机制。方法：配制丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物（丹参酮ⅡA与隐丹参酮标准品按照1∶1的比例配置）溶液，采用TGF-β1诱导HSF细胞增殖构建增生性瘢痕体外细胞模型；采用MTT法测定丹参酮ⅡA与隐丹参酮对HSF细胞增殖的影响；采用Western Blot法检测HSF细胞中TGF-β1/Smad信号通路下游信号分子p-Smad2、Smad3蛋白以及Survivin蛋白表达水平变化。结果：丹参酮ⅡA与隐丹参酮能剂量依赖地抑制HSF细胞的增殖，降低p-Smad2、Smad3蛋白和Survivin蛋白表达水平。结论：丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物可能通过下调p-Smad2、3和Survivin蛋白的水平，抑制HSF细胞的增殖，发挥抑制瘢痕的作用。

[关键词]丹参酮ⅡA；隐丹参酮；人皮肤成纤维细胞；转化生长因子-β1；瘢痕

[中图分类号]R285    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）09-0054-04

Inhibition of Tanshinone ⅡA and Cryptotanshinone  Mixture on Human Skin Fibroblasts Based on TGF-β1

XIN Linlin，WANG Haonan，ZHANG Zhe，BAI Yanhong，LIU Hongyan，ZHOU Ying，LI Qingjun，LIU Qian，ZHANG Yongqing

（College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，Shandong，China）

Abstract： Objective  To explore the effect and mechanism of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture on the proliferation of fibroblasts stimulated by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， and to provide a theoretical basis for further development and utilization of Danshen. Methods  Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture （Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone were mixed at a ratio of 1∶1） was prepared to treat human skin fibroblasts （HSF） cells which was stimulated by TGF-β1. The effect of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone on the proliferation of HSF cells was determined using MTT method. The expression levels of protein p-Smad2， 3 and Survivin， downstream signals of TGF-β1/Smad pathway， were determined by western blot （WB）. Results  The results showed that tanshinone ⅡA and cryptotanshinone could inhibit the proliferation of HSF cells and suppress the expression levels of p-Smad2， 3 and Survivin in a dose-dependent manner. Conclusion  Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone mixture could inhibit the proliferation of HSF cells by significantly reducing the phosphorylation of Smad2 and 3， and down-regulating the expression level of Survivin.

Key words： tanshinone ⅡA; cryptotanshinone; human skin fibroblast; transforming growth factor-β1; scar

丹參为唇形科植物丹参的干燥根与根茎[1]，始载于《神农本草经》，具有活血化瘀、清心除烦、通经止痛、凉血消痈等功效。药理研究证明，丹参对心、肝、肺、肾等脏器具有显著的抗纤维化作用[2-4]，一般认为是通过抑制HSF增殖与胶原纤维累积而实现的。本课题组前期对民间验方丹参膏进行工艺优化制成灭瘢膏，并对灭瘢膏进行成分和药效研究，结果显示，丹参酮ⅡA与隐丹参酮是灭瘢膏发挥抗皮肤组织纤维化的主要有效成分，含量分别为2.11 mg/g与2.20 mg/g且比例接近1∶1。为进一步提高灭瘢膏的制剂工艺水平和临床疗效，本研究继续通过TGF-β1诱导HSF细胞，从细胞和分子层面研究丹参酮ⅡA与隐丹参酮抑制瘢痕形成的机制。

1  材料和方法

1.1 细胞来源：人皮肤成纤维细胞（HFF-1，167921）购自中国科学院干细胞库，培养扩增，取第3～8代细胞用于实验。

1.2 药物和试剂：羊脂（20200616，泰安明睿有限公司），丹参酮ⅡA标准品（Y16M10C88487，上海源叶生物科技有限公司），隐丹参酮标准品（C28M6Y1，上海源叶生物科技有限公司）；HFF-1特殊培养基（167921，中国科学院干细胞库）；胎牛血清（10270-106，Gibco）；p-Smad2抗体（#18338，Cell Signaling Technolog）、p-Smad 3抗体（#9520，Cell Signaling Technolog）；Survivin蛋白抗体（ab134170，Abcam），GAPDH抗体（ab179695，Abcam）；BCA总蛋白测定试剂盒（20201218，南京建成工程生物工程研究所）。

1.3 仪器：XD-101 CO2细胞培养箱（Sanyo）；IX 71生物倒置显微镜、倒置荧光显微镜（Olympus）；muLISKANMK3酶标仪（Thermo）；EPS300垂直电泳槽，Tanon 4 600全自动化学发光分析仪（Tanon）。

1.4 方法

1.4.1 HSF细胞培养条件与药品配置

1.4.1.1 细胞培养条件：HSF细胞用HFF-1特殊培养基于37℃、5% CO2、95% 相对饱和湿度环境下静置培养至第3～8代，取生长状态良好的对数期细胞进行试验。

1.4.1.2 丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液配置：精密称取丹参酮ⅡA与隐丹参酮，按照1μmol/L丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液=1μmol丹参酮ⅡA+1 μmol隐丹参酮配制；为保证二甲基亚砜（DMSO）最终浓度为0.5%，以配置最高浓度64 mol/L的丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液为例，先配置10 ml浓度为12.8 mmol/L的丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液，原溶液经2倍稀释混匀成各浓度待用，给药处理时取10μl原溶液与90μl培养基混合成混合液，取混合液10μl加入至细胞培养孔中（190μl）即可。

1.4.2 丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1干预下HSF细胞增殖数的测定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接种至96孔细胞培养板中孵育过夜后，将细胞分为blank组（0μmol/L丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液），TGF-β1组（0μmol/L丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液），丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物给药组（1、2、4、8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物溶液）。TGF-β1组、丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物给药组用5 ng/ml的TGF-β1干预处理2 h后全部分别按上述浓度给药处理；孵育0 h和48 h时取出培养板，将稀释在HFF-1特殊培养基中的MTT溶液加入孔中培养4 h后，移至酶标板中检测各组595 nm处吸光度（A）值。

1.4.3 丹參酮ⅡA和隐丹参酮对HSF细胞增殖数的测定：采用MTT法，以每孔4×104/100μl的密度接种至96孔细胞培养板中孵育过夜后，将细胞分为blank组（0μmol/L），丹参酮ⅡA组（2、4、8、16、32、64μmol/L丹参酮ⅡA），隐丹参酮组（2、4、8、16、32、64μmol/L隐丹参酮），丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物给药组（1、2、4、8、16、32μmol/L丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物）全部分组按上述浓度给药处理；孵育0 h和48 h时取出培养板，将稀释在HFF-1特殊培养基中的MTT溶液加入孔中培养4 h后，移至酶标板中检测各组595 nm处吸光度（A）值。

1.4.4 丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1干预下HSF细胞中p-Smad2/3，Survivin蛋白表达水平检测：取细胞样本于离心管中加150μl裂解液超声1 min后于冰上裂解30 min，裂解完毕后于4 ℃下12 000 r/min离心15 min后吸取上清液，用BCA试剂盒测定蛋白浓度；内参蛋白为GAPDH，在10%SDS-PAGE凝胶电泳中进行蛋白质分离，转到PVDF膜上，室温孵育1 h后4℃与下列抗体孵育过夜：p-Smad2（1∶1 000），p-Smad3（1∶1 000），Survivin（1∶300），GAPDH（1∶5 000），洗膜3次后加过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG作为二抗，室温孵育40 min后洗膜3次，加免疫增强化学发光（ECL）剂反应2 min后观察拍照。

1.5 统计学分析：用Image J软件对WB条带进行灰度分析，SPSS 23.0软件对实验数据进行统计分析，数据结果以（x¯±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2  结果

2.1 丹参酮ⅡA和隐丹参酮对HSF细胞增殖的影响：在48 h内，丹参酮ⅡA和隐丹参酮对HSF细胞增殖均起抑制作用，并呈剂量依赖性，浓度越高抑制作用越强，丹参酮ⅡA与隐丹参酮的IC50分别为：39.715 μmol/L、57.024μmol/L。见图1。在干预48 h后，丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对HSF细胞起到抑制作用，IC50为29.705μmol/L，在不添加TGF-β1诱导的条件下，丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对HSF的抑制作用呈剂量依赖性，浓度越高抑制作用越强。见图2。

2.2 丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1诱导下HSF细胞增殖的影响：与blank组比较，TGF-β1干预可显著促进HSF细胞增殖（P＜0.01）。丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1诱导下的HSF细胞抑制率随其浓度增加而升高，48 h时丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1诱导下HSF细胞IC50为41.949μmol/L。见图3。

2.3 丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对TGF-β1诱导下HSF细胞中Smad2/3蛋白磷酸化和Survivin蛋白表达的影响：与blank组比较，TGF-β1干预可显著促进HSF细胞的Smad2、3蛋白磷酸化水平与Survivin蛋白表达水平（P＜0.01），而丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物干预可明显抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3蛋白磷酸化水平及Survivin蛋白表达水平，且抑制效果呈现剂量依赖。结果可表明丹参酮ⅡA与隐丹参酮可能通过抑制TGF-β1/Smad通路中Smad2/3磷酸化，下调Survivin蛋白表达水平，促进HSF细胞凋亡，进而抑制瘢痕形成。见图4。

3  讨论

增生性瘢痕是一种纤维代谢性疾病，随着细胞、分子生物学的不断研究，发现细胞增生和凋亡失衡或许是增生性瘢痕形成的重要病理学基础[5-6]。现代医学研究认为其细胞凋亡不足、促凋亡基因或凋亡抑制基因表达紊乱都会导致瘢痕的产生[7]。HSF细胞参与皮肤创面愈合与瘢痕形成的全过程，研究发现，HSF细胞凋亡不足可能是导致增生性瘢痕产生的重要原因[8-9]。

中药或中药提取物能有效抑制瘢痕组织的形成并减少肌肤红肿或过敏等副作用[10]。丹参作为常用大宗药材之一，具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、改善微循环和调节免疫等多种药理作用，是治疗增生性瘢痕的潜在药物[11-12]。研究表明，丹参酮ⅡA可以诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能与抑制Survivin蛋白表达有关[13]。Zhan CY等[14]研究发现丹参酮ⅡA可以抑制TGF-β1诱导的大鼠心脏HSF中Smad2/3磷酸化，阻断TGF-β1/Smad信号通路的表达，降低心肌纤维化。杨莉等[15]研究发现，隐丹参酮可以抑制兔耳增生性瘢痕产生，其机制可能与TGF-β1/Smad信号通路有关，但尚未涉及隐丹参酮对HSF细胞的干预功能及其作用机制。本实验以培养HSF细胞为研究对象，通过MTT实验评价隐丹参酮与丹参酮ⅡA与对细胞活性的影响。结果显示，与空白对照组相比，两种丹参酮对HSF细胞增殖活性均起到一定的抑制作用，浓度越高抑制作用越强。经计算，在48 h内，隐丹参酮、丹参酮ⅡA和丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物对HSF细胞的IC50分别为57.024、39.715 和29.705μmol/L，丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物与单纯使用隐丹参酮、丹参酮ⅡA的IC50分别降低了47.91%与25.20%，提示相同作用时间下，丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物能显著抑制HSF细胞的增殖，减少瘢痕产生。

TGF-β1是与增生性瘢痕形成关系最密切的因子，能调控细胞生长分化，调节胶原蛋白积累，维持纤维化平衡[16]。大量研究表明，TGF-β1通过激活Smad介导的TGF-β1/Smad信号通路参与胶原纤维代谢的调控，对伤口愈合和瘢痕形成的发生和发展起到重要作用[17]。Survivin蛋白是目前已知最强凋亡蛋白抑制因子，与Caspase家族相互作用后，可以抑制HSF细胞凋亡，造成HSF细胞大量繁殖和胶原过度沉积[18]。已有研究证明，敲低Survivin蛋白的前列腺癌细胞中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4表达水平明显降低，Survivin蛋白过表达则可以增加TGF-β1、Smad4表达，促进Smad2/3磷酸化[19]。同样在银屑病皮损组织中发现TGF-β1可以激活Survivin蛋白的表达，通过TGF-β1/Survivin途径干扰细胞增殖和凋亡[20]。本研究探讨了丹参酮ⅡA与隐丹参酮对TGF-β1/Smad信号通路中p-Smad2/3、Survivin蛋白表达。Western Blot结果显示，HSF细胞在TGF-β1诱导下，细胞增殖活性显著增强，其Survivin蛋白以及p-Smad2/3水平显著上升，在丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物进行处理后，细胞增殖活性降低，Survivin、p-Smad2/3水平降低。

综上所述，丹参酮ⅡA与隐丹参酮对HSF细胞增殖起到抑制作用，可以减少增生性瘢痕的产生，为进一步开发丹参用于外伤治疗提供借鉴参考。

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[收稿日期]2022-07-13

本文引用格式：辛林林，王浩南，张喆，等.丹参酮ⅡA与隐丹参酮混合物基于TGF-β1抑制人皮肤成纤维细胞的研究[J].中国美容医学，2023，32（9）：54-57.