热水漂烫对红辣椒乙醇提取物的抗氧化活性及其生物有效性的影响

吕俊丽,李莅萍,王国泽

(内蒙古科技大学 生命科学与技术学院,内蒙古 包头 014010)

辣椒含有多种营养成分,如蛋白质、类胡萝卜素、微量元素和维生素[1-2],具有增加食欲、促进血液循环等功效[3]。红辣椒既可作为蔬菜被广泛食用,又可被加工成天然着色剂或调味料,以丰富食物的颜色和风味。红辣椒中的辣椒红素约占色素总量的60%[4],其色泽鲜艳、安全性强,是一种天然优质的色素,同时也是辣椒中主要的生物活性物质[5],具有抗氧化[6-7]、抗炎[8]、抑菌[9]等功能,可预防癌症、动脉硬化、肥胖[10]以及老年人的眼科疾病[11]等。

我国是世界上最大的辣椒生产国和消费国[12]。红辣椒水分含量较高,采后贮藏时易发生腐烂变质现象。干燥不仅可以有效延长红辣椒的贮藏期,而且是加工辣椒粉等调味品的常用方法之一。而漂烫是果蔬干燥前的关键步骤,其不仅可以清洁果蔬表面,杀死表面微生物[13],而且可破坏果蔬的氧化酶系统,达到灭酶、护色的效果。另外,漂烫还可以激活果胶甲酯酶[14],具有稳定原料组织脆度的作用[15]。目前,国内外针对辣椒的研究主要集中在辣椒酱等产品的加工和辣椒红素的提取[16-17]、应用[18]及稳定性[19-20]等方面,漂烫研究主要关注果蔬的灭酶护色等方面,有关漂烫对红辣椒的抗氧化活性及其生物有效性影响的研究鲜见报道。生物有效性指从食物基质/传递系统中释放出可供吸收的量,反映了物质能够被吸收的可能性[21]。而体外消化模型能够客观地评估营养物质在体内各个阶段的生物有效性[22]。因此,本研究选取两个不同品种的红辣椒为原料,以未漂烫的辣椒为对照,研究漂烫对红辣椒乙醇提取物抗氧化活性的影响,并采用体外模拟消化模型,进一步探究其对红辣椒中抗氧化活性生物有效性的影响。本研究结果为探究辣椒加工过程中营养组分生物活性的变化提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小米椒、大红椒:购于永辉超市。

没食子酸、辣椒红素、DPPH(均为分析纯):阿拉丁试剂(上海)有限公司;福林酚、猪胃蛋白酶、α-淀粉酶、胆汁盐、胰酶:北京索莱宝科技有限公司;30% H2O2：天津市天力化学试剂有限公司;无水乙醇、水杨酸、碳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、乙酸乙酯、氢氧化钠(均为分析纯):上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DZF-6050B真空干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;SHA-B恒温摇床 武汉中科科仪技术发展有限责任公司;pH计 奥豪斯仪器有限公司;MC8S-1A微波超声波萃取仪 南京汇研微波系统工程有限公司;NDK200-1氮气吹扫仪 上海百典仪器设备有限公司;LYNX 4000冷冻离心机 上海辅泽商贸有限公司;UV-2600紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

将市售新鲜红辣椒洗净,放入沸水中漂烫5 min后取出,放入真空干燥箱中50 ℃恒温烘干。烘干后去籽留皮,粉碎,过40目筛后备用。

1.3.2 红辣椒乙醇提取物的制备

向辣椒粉样品中按照料液比为1∶25加入95%的乙醇提取剂,置于微波萃取仪中,微波功率为300 W,提取2 min后以3 500 r/min离心10 min,取上清液,定容至25 mL,冷藏备用。

1.3.3 辣椒红素含量的测定

1.3.3.1 辣椒红素标准曲线

精确称取一定量的辣椒红素标准品,用95%的乙醇溶解,分别配成50,100,150,200,250 μg/mL辣椒红素标准品溶液。用95%乙醇定容至刻度并静置10 min。以95%乙醇为参照,于460 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标、辣椒红素浓度为横坐标,绘制标准曲线。标准曲线回归方程:y=0.003 7x+0.047 1,R2=0.999。

1.3.3.2 辣椒红素含量的测定

将红辣椒乙醇提取物稀释至一定倍数,振荡10 min,于460 nm波长处测定吸光度,用95%的乙醇溶液作参比,从标准曲线上读出待测溶液中辣椒红素的浓度,计算辣椒红素的含量。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的测定

取2.0 mL待测样品置于10 mL试管中,并加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液,摇匀,室温下避光反应30 min,在517 nm处测定吸光度,记为A1。用2.0 mL 95%乙醇溶液代替待测样品,测定吸光度,记为A0。DPPH·清除率(η)的计算公式如下:

(1)

1.3.4.2 羟自由基清除率的测定

向待测样品中依次加入1 mL 10 mmol/L的FeSO4、1 mL 10 mmol/L的水杨酸、1 mL 8.8 mmol/L的H2O2,37 ℃下反应30 min,在510 nm波长处测定的吸光度记为A1,以1 mL蒸馏水代替H2O2,测定的吸光度记为A2,以1 mL蒸馏水代替待测样,测定的吸光度记为A0。羟自由基清除率计算公式如下:

(2)

1.3.4.3 还原力的测定

移取2.5 mL待测液,加入2.5 mL 1%的铁氰化钾,于50 ℃水浴锅中加热20 min后,加入2.5 mL 10%三氯乙酸,以3 000 r/min离心10 min去除反应体系中多余的三氯乙酸,移取5 mL上清液,依次加入5 mL蒸馏水、1 mL 0.1%的三氯化铁溶液,在700 nm处测定吸光度A1。吸光度越大表明还原能力越强。用蒸馏水代替铁氰化钾,测得的吸光度记为A0。计算公式如下:

还原力(%)=(A1-A0)×100%。

(3)

1.3.5 体外模拟消化

1.3.5.1 模拟消化液的配制

模拟口腔液:取1.3 gα-淀粉酶溶于100 mL 1 mmol/L CaCl2中,pH为7.0;模拟胃液:取4 g胃蛋白酶溶于100 mL 0.01%的HCl溶液中;模拟肠液:取0.4 g胰酶与2.5 g胆汁盐溶于100 mL 0.1 mol/L pH 7.0的碳酸钠缓冲液中。

1.3.5.2 模拟口腔消化

称取1 g漂烫后的辣椒粉,以未漂烫的辣椒粉作对照,依次加入20 mL水、0.5 mL模拟口腔液,置于37 ℃恒温摇床,以100 r/min消化10 min,得到口腔消化液。取1 mL口腔消化液,加入95%乙醇提取2 min后,以8 000 r/min离心10 min,取上清液,充氮,4 ℃密封保存,测定抗氧化活性及辣椒红素含量。

1.3.5.3 模拟胃消化

对模拟口腔消化后的消化液进行胃消化。用0.1 mol/L HCl调节pH至2.0,加入4 mL模拟胃液,充氮除氧,置于37 ℃恒温摇床,以100 r/min 消化2 h后,得到胃消化液。取1 mL胃消化液,加入95%乙醇提取2 min后,以8 000 r/min离心10 min,取上清液,充氮,4 ℃密封保存,测定抗氧化活性及辣椒红素含量。

1.3.5.4 模拟肠消化

将胃消化液迅速置于冰水中冷却,用0.1 mol/L NaOH调pH至5.3,加入5 mL模拟肠液后调pH至7.2,充氮除氧,置于37 ℃恒温摇床,以80 r/min消化 2 h,得到模拟肠消化样液。以8 000 r/min离心后取上清液,测定抗氧化活性及辣椒红素含量。

1.3.6 生物有效性

(4)

式中:PCA表示体外消化不同阶段消化液的抗氧化活性或辣椒红素含量;PCB表示体外消化之前红辣椒乙醇提取物的抗氧化活性或辣椒红素含量。

1.3.7 数据处理方法

采用SPSS 18.0软件分析数据,GraphPad Prism作图,结果用平均值±标准差表示(n=3)。

2 结果与分析

2.1 漂烫对红辣椒乙醇提取物抗氧化活性及辣椒红素含量的影响

2.1.1 漂烫对不同品种红辣椒乙醇提取物抗氧化活性的影响

对小米椒和大红椒进行漂烫处理后,乙醇提取物的抗氧化结果见表1。

表1 漂烫对不同品种红辣椒乙醇提取物抗氧化活性的影响

由表1可知,未漂烫小米椒乙醇提取物的羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原力分别为53.62%、36.81%、14.70%,漂烫后分别为48.63%、30.14%、12.07%,漂烫后小米椒乙醇提取物的羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原力分别降低了4.99%、6.67%、2.63%。未漂烫大红椒乙醇提取物的羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原力分别为53.25%、33.02%、28.07%,漂烫后分别为43.27%、26.02%、23.60%,比未漂烫的大红椒分别降低了9.98%、7.00%、4.47%,说明漂烫处理降低了红辣椒提取物的抗氧化活性。张文娥等[24]研究指出,漂烫可显著降低核桃雄花序的抗氧化活性,与本研究结果相吻合。

2.1.2 漂烫对不同品种红辣椒中辣椒红素含量的影响

红辣椒乙醇提取物主要包括辣椒红素(约50%)和玉米黄质(约14%)[11,25]。为了进一步分析漂烫处理对红辣椒乙醇提取物抗氧化活性影响的原因,本研究选取提取物中含量较多的辣椒红素为代表,进一步探究漂烫对红辣椒乙醇提取物中抗氧化成分的影响。

以未漂烫的小米椒和大红椒作对比,研究漂烫对辣椒红素含量的影响,结果见图1。

图1 漂烫对不同品种红辣椒中辣椒红素含量的影响

由图1可知,经过漂烫处理后两种辣椒中辣椒红素含量均显著降低(P<0.05),此变化趋势与张瑞[26]的研究结果一致。小米椒中辣椒红素的含量由30.64 mg/g降至26.81 mg/g,降低了12.50%;大红椒中辣椒红素的含量由37.33 mg/g降至33.37 mg/g,降低了11.54%。结合表1的数据可知,热水漂烫对辣椒红素含量的影响与红辣椒提取物抗氧化活性的变化趋势一致,说明辣椒红素含量是保证消化前红辣椒乙醇提取物抗氧化能力的主要因素。韩晓岚等[27]在探究辣椒红素稳定性的实验中指出,辣椒红素在温度为25～70 ℃时较稳定。张瑞[26]进一步证实热处理温度越高,类胡萝卜素损失量越多,其中辣椒红素的降解速率最快。

2.2 漂烫对红辣椒体外模拟消化过程中抗氧化活性及辣椒红素含量的影响

2.2.1 漂烫对体外模拟消化过程中抗氧化能力的影响

由图2可知,与未漂烫的红辣椒相比,红辣椒漂烫后在体外模拟消化过程中对羟自由基的清除率均显著降低(P<0.05)。在消化过程中,未漂烫的小米椒提取物对羟自由基的清除率从口腔到肠分别为57.47%、66.90%、75.65%,漂烫后小米椒提取物对羟自由基的清除率从口腔到肠分别为46.82%、51.59%、59.06%,漂烫后分别下降了10.65%、15.31%、16.59%。未漂烫的大红椒提取物对羟自由基的清除率从口腔到肠分别为51.98%、66.47%、74.82%,漂烫后对应的值分别为41.57%、49.24%、58.46%,漂烫后大红椒在口腔、胃、肠内对羟自由基的清除率分别下降了10.41%、17.23%、16.36%。

图2 漂烫对红辣椒消化过程中羟自由基清除能力的影响

由图3可知,体外模拟消化过程中,漂烫后两种红辣椒提取物对DPPH自由基的清除能力均较未漂烫的辣椒低。在消化过程中,未漂烫的小米椒在口腔、胃、肠内对DPPH自由基的清除率分别为37.27%、51.01%、57.65%,漂烫后对应的DPPH自由基清除率分别为24.78%、36.84%、41.98%,漂烫后分别下降了12.49%、14.17%、15.67%。未漂烫的大红椒提取物对DPPH自由基的清除率从口腔到肠分别为43.30%、53.24%、65.47%,漂烫后对应的DPPH自由基清除率分别为23.33%、37.62%、51.44%,漂烫后分别下降了19.97%、15.62%、14.03%。

图3 漂烫对红辣椒消化过程中DPPH自由基清除能力的影响

由图4可知,漂烫后两种红辣椒体外模拟消化过程中还原力均较未漂烫的辣椒低。漂烫后小米椒在口腔、胃、肠内的还原力比未漂烫的小米椒分别下降了3.53%、14.03%、13.20%,漂烫后大红椒在口腔、胃、肠内的还原力比未漂烫的大红椒分别下降了9.24%、6.70%、5.73%。

图4 漂烫对红辣椒消化过程中还原力的影响

2.2.2 漂烫对体外模拟消化过程中辣椒红素含量的影响

为了分析漂烫对红辣椒在消化过程中抗氧化活性影响的原因,本研究对漂烫前后辣椒红素在消化过程中的变化做了进一步研究。漂烫对体外模拟消化过程中辣椒红素含量的影响见表2。

表2 漂烫对体外模拟消化过程中辣椒红素含量的影响

从口腔到肠消化过程中,不同处理的两种红辣椒中辣椒红素含量不断增加,在肠消化时辣椒红素含量最高。在整个消化阶段,未漂烫的小米椒中辣椒红素含量由口腔到肠消化增加了79.01%,漂烫后小米椒中辣椒红素含量增加了108.80%;未漂烫的大红椒中辣椒红素含量由口腔到肠消化增加了113.97%,漂烫后大红椒中辣椒红素含量增加了94.56%。李莉等[28]研究指出,辣椒中的辣椒红素主要存在于果皮色素母细胞中的类囊体膜上,在消化过程中胃肠道中的酸、酶将辣椒红素与膜连接的化学键破坏,从而有利于辣椒红素等色素的释放,使得辣椒红素在肠道中的含量增加。

以未漂烫红辣椒作为对照,在口腔消化阶段,小米椒经漂烫后辣椒红素含量降低了38.27%,大红椒经漂烫后辣椒红素含量降低了19.45%;在胃消化阶段,小米椒经漂烫后辣椒红素含量降低了14.46%,大红椒经漂烫后降低了12.19%;在肠消化阶段,小米椒经漂烫后辣椒红素含量降低了28.00%,大红椒经漂烫后降低了26.76%。有研究指出,70%～80%的色素与脂肪酸结合,以色素酯的形式存在,从而增加其稳定性[29]。高温漂烫可使色素细胞的细胞壁破裂,以色素酯形式存在的类胡萝卜素得以释放,在氧气的作用下易被氧化。此外,高温漂烫也可促进类胡萝卜素发生异构化反应,由反式转化为顺式,稳定性降低,在消化道中酸和酶的作用下降解进一步加快[30]。以上数据说明,漂烫处理可显著降低两种辣椒在各消化阶段的辣椒红素含量(P<0.05)。该结果与体外模拟消化过程中抗氧化活性的变化趋势基本一致。

2.3 生物有效性比较

2.3.1 漂烫对红辣椒乙醇提取物抗氧化活性生物有效性的影响

漂烫对红辣椒乙醇提取物羟自由基清除生物有效性的影响见图5。

由图5可知,小米椒经漂烫后在口腔、胃、肠消化过程中羟自由基清除生物有效性分别下降了2.92%、18.69%、22.81%;大红椒经漂烫后分别下降了1.55%、6.04%、5.41%。

漂烫对红辣椒乙醇提取物DPPH自由基清除生物有效性的影响见图6。

图6 漂烫对红辣椒乙醇提取物DPPH自由基清除生物有效性的影响

由图6可知,小米椒经漂烫后在口腔、胃、肠消化过程中分别下降了19.02%、16.32%、17.31%;大红椒经漂烫后分别下降了41.48%、16.66%、0.58%。

漂烫前后红辣椒乙醇提取物还原力的生物有效性见图7。

图7 漂烫对红辣椒乙醇提取物还原力生物有效性的影响

由图7可知从口腔到肠消化过程中还原力的生物有效性,未漂烫的小米椒分别为83.67%、246.26%、234.92%,漂烫后分别下降了11.02%、62.56%、58.12%;未漂烫的大红椒分别为72.21%、120.19%、109.38%,漂烫后分别下降了25.46%、5.64%、3.59%。

由图5～图7可知,漂烫对小米椒和大红椒乙醇提取物抗氧化活性生物有效性的影响程度不相同。对于大红椒,除DPPH自由基清除生物有效性外,漂烫对羟自由基清除和还原力在胃、肠消化时的生物有效性影响不显著(P>0.05),对小米椒而言,漂烫可显著降低胃、肠消化时的抗氧化活性生物有效性(P<0.05),这主要与红辣椒的品种不同有关。

2.3.2 漂烫对辣椒红素生物有效性的影响

漂烫处理前后辣椒红素含量的生物有效性见表3。

表3 漂烫对辣椒红素在消化过程中生物有效性的影响

由表3可知,不同处理的红辣椒在消化过程中辣椒红素的生物有效性逐渐增加,在肠消化时生物有效性最高。未漂烫的小米椒中辣椒红素生物有效性从口腔消化时的14.17%增到了肠消化时的23.70%,增加幅度为9.53%;漂烫的小米椒辣椒红素的生物有效性从10.77%增到了19.91%,增加幅度为9.14%。未漂烫的大红椒中辣椒红素的生物有效性从10.83%(口腔消化)增到了21.16%(肠消化),增加幅度为10.33%;漂烫的大红椒中辣椒红素的生物有效性从10.06%(口腔消化)增到了17.70%(肠消化),增加幅度为7.64%。对比以上数据可以得出,漂烫处理后的红辣椒在消化道内生物有效性的增加幅度小于未漂烫的红辣椒。

与未漂烫的红辣椒相比,漂烫后的小米椒在口腔、胃、肠消化时辣椒红素的生物有效性分别降低了3.40%、0.25%、3.79%,漂烫后的大红椒在口腔、胃、肠消化时辣椒红素的生物有效性分别降低了0.77%、0.18%、3.46%。Pugliese等[31]的研究也证实了煮沸可以降低辣椒中类胡萝卜素的生物有效性。对比以上数据,漂烫处理对大红椒在消化过程中辣椒红素生物有效性的影响幅度小于小米椒,这为漂烫对大红椒乙醇提取物的羟自由基清除和还原力生物有效性的影响不显著(见图5和图7)提供了可能的证据。

3 结论

经过漂烫处理后两种红辣椒的抗氧化活性及辣椒红素含量均显著降低(P<0.05)。以未漂烫红辣椒作为对照,漂烫后小米椒乙醇提取物的羟自由基清除率、DPPH自由基清除率、还原力、辣椒红素含量分别降低了4.99%、6.67%、2.63%、12.50%;大红椒经漂烫后分别降低了9.98%、7.00%、4.47%、11.54%。在口腔、胃、肠消化阶段,小米椒经漂烫后羟自由基清除生物有效性分别下降了2.92%、18.69%、22.81%;大红椒经漂烫后分别下降了1.55%、6.04%、5.41%;小米椒经漂烫后DPPH自由基清除生物有效性分别下降了19.02%、16.32%、17.31%,大红椒经漂烫后分别下降了41.48%、16.66%、0.58%;小米椒经漂烫后还原力的生物有效性分别下降了11.02%、62.56%、58.12%,大红椒经漂烫后分别下降了25.46%、5.64%、3.59%;漂烫后小米椒辣椒红素的生物有效性分别降低了3.40%、0.25%、3.79%,漂烫后大红椒辣椒红素的生物有效性分别降低了0.77%、0.18%、3.46%,说明漂烫对小米椒和大红椒乙醇提取物抗氧化活性生物有效性的影响程度不同,后续应增加辣椒品种。本研究为深入探究加工对红辣椒中抗氧化活性成分在消化过程中的生物有效性提供了数据参考。