提取工艺对辣椒红素色价及得率的影响

李甜甜，林意雯，王飞*，李亚会，李积华，权乔凤，韩志萍

（1.中国热带农业科学院 农产品加工研究所，广东 湛江 524001；2.华中农业大学 食品科学技术学院，湖北 武汉 430000；3.海南省果蔬贮藏与加工重点实验室，广东 湛江 524001；4.海南省种子总站，海南 海口 570100；5.岭南师范学院，广东 湛江 524001）

辣椒红素是存在于红辣椒中的一种天然类胡萝卜素，是类胡萝卜素合成途径终端产物，是脂溶性天然色素，极易溶于植物油和乙醇[1-3]。辣椒红素分子式为C40H56O3，化学结构为8-甲基-N-香草基-6-壬烯基，结构式见图1。辣椒红素属共轭多烯烃含氧衍生物，通常是一种具有辣椒香气味的深红色黏性油状液体，纯辣椒红素是深胭脂红色针状结晶体，较易溶于有机溶剂，不溶于水和甘油[4-5]。作为一种天然红色素，辣椒红素具有很高的生理活性，凭借色泽鲜艳、着色力强、热稳定性好、无任何毒害作用、安全性高等特性被广泛应用于食品、饮料、保健药品、化妆品等领域[6-7]。优化辣椒红素提取工艺不仅能提高辣椒附加值，也能促进深加工产业化生产。辣椒红素是目前国际上公认最好的红色素，被联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为A类食用色素，在使用中不加以限量[8-10]。

图1 辣椒红素结构图Fig.1 The chemical structure of capsanthin from red chilli

辣椒红素提取工艺有油溶法、有机溶剂法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法、亚临界流体萃取法、超临界CO2流体萃取法等[11-12]。目前有机溶剂提取、单酶提取、微波辅助提取、超声波辅助提取、超临界CO2流体萃取的研究较成熟，但复合酶提取和亚临界流体萃取辣椒红素鲜有研究。

本文选用新疆焉耆干红辣椒为原料，采用有机溶剂法、超声辅助法、酶辅助法和亚临界流体萃取法4种工艺提取辣椒红素，以色价和得率为评价指标，对4种提取工艺进行对比分析，阐明不同提取工艺对色价和得率的影响机制，以期为辣椒红素深加工和产业化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新疆焉耆干红辣椒：市售，去籽干燥，粉碎过20目筛备用；正己烷、正丁烷、乙酸乙酯、95%乙醇、丙酮（分析纯）：广州光华科技股份有限公司；纤维素酶（酶活力≥50 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司。

紫外可见分光光度计（UV1780）：日本岛津公司；电热鼓风箱（WGLL-230BE）：吴江超宇烘箱制造有限公司；真空冷冻干燥机（ALPHA 2-4）、旋转蒸发仪（LR4002）：德国CHRIST公司；多功能粉碎机（FLBP-1000A）：上海非力博食品机械有限公司；恒温振荡箱（ZD-85）：苏州国华仪器有限公司；数显恒温水浴锅（HH-S8）：常州普天仪器制造有限公司；超声波清洗机（G-020）：深圳市歌能清洗设备有限公司；亚临界流体萃取仪（CBE-5L）：中国农业科学院油料作物研究所；高速离心机（GT16-3）：湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最长吸收波长及最佳有机溶剂的选择

称取10.0 g辣椒粉，分别采用95%乙醇、乙酸乙酯、正己烷作为提取溶剂，设定液料比 5∶1（mL/g），在60℃条件提取1 h，抽滤后取滤液，通过旋转蒸发仪浓缩至质量恒定的辣椒红素粗产品并回收溶剂，采用紫外可见分光光度计测定吸光度，计算色价及得率。每组重复3次。

1.2.2 有机溶剂法提取辣椒红素

称取10.0 g辣椒粉，以正己烷为提取溶剂，以色价和得率为评价指标，采用单因素试验优化提取工艺参数，分别考察液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）]、提取温度（20、40、60、70 ℃）、提取时间（1、2、3、4 h）对色价及得率的影响。

1.2.3 超声辅助法提取辣椒红素

称取10.0 g辣椒粉，以正己烷为提取溶剂，以色价和得率为评价指标，在超声功率100 W条件下采用单因素试验优化提取工艺参数，分别考察了液料比[4∶1、5∶1、6∶1、7∶1（mL/g）]、超声温度（30、40、50、60 ℃）、超声时间（20、40、60、80 min）对色价及得率的影响。

1.2.4 酶法辅助提取辣椒红素

称取10.0 g辣椒粉，移至50 mL纤维素酶溶液中，在一定温度下进行酶解。酶解后在100℃沸水中进行灭酶15 min后离心10 min（离心转速5 000 r/min），去上清液后得到辣椒粉酶解产物，按超声辅助最优条件进行提取。提取后抽滤，取滤液采用旋转蒸发仪浓缩至质量恒定的辣椒红素粗产品并回收溶剂，测定吸光度，计算色价及得率。采用单因素试验优化提取工艺参数，分别考察酶添加量（0%、0.1%、0.3%、0.5%）、酶解时间（1、2、3、4 h）、酶解温度（25、30、35、40、45 ℃）对色价及得率的影响。

1.2.5 亚临界流体萃取辣椒红素

采用CBE-5L型亚临界设备萃取辣椒红素，设定工艺参数：萃取剂正丁烷、萃取温度45℃、萃取压力0.38MPa、液料比 8∶1（mL/g）、萃取时间 1h。称取 300.0g辣椒粉置于网兜中，系口后置入萃取罐中，加盖密封。将萃取系统升温至45℃时抽真空，抽真空后导入2.4 L正丁烷，静态浸泡萃取1 h。萃取结束后将萃取液置于分离罐中，然后与萃取罐隔离，开启压缩机分别对两罐进行减压和溶剂回收。当两罐中绝对压力降至0.15MPa以下时，开启真空泵与压缩机串联工作，直至两罐绝对压力降为0.01 MPa后，脱溶结束。从分离罐底部取出萃取辣椒红素粗产品，称量并记录，置于4℃冰箱中保存，计算色价及得率。

1.3 辣椒红素的检测方法

1.3.1 标准曲线的建立

准确称取0.005g辣椒红素标准品，精确至0.0001 g，用丙酮稀释定容在1 mL离心管中，配成浓度为0.5 mg/mL的辣椒红素标准品溶液。精密吸取上述标准溶液0.001、0.002 、0.004、0.006、0.008 mL 分别置于 1 mL 离心管中，用丙酮定容至刻度，摇匀，放置l0 min，以0号管（丙酮）为参照，于460 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标、辣椒红素浓度为横坐标，绘制标准曲线[13-14]，见图2。根据试验结果，得到辣椒红素的标准曲线，回归方程为y=5.458 9x+0.007 6，相关系数R2=0.996 4，该方法线性关系良好。

图2 辣椒红素标准曲线Fig.2 Standard curve of capsanthin

1.3.2 样品中辣椒红素色价的测定

色价是考察辣椒红素的重要指标[15]，按照GB 1886.34—2015《食品安全国家标准食品添加剂辣椒红》规定的方法采用紫外可见分光光度计测定辣椒红素色价。准确称取0.1 g试样，精确至0.000 1 g，用丙酮稀释于100 mL容量瓶中，再精确吸取稀释溶液10mL，稀释至100mL，在波长460 nm下，以丙酮作参比液，于1 cm比色皿中测定其吸光度。使用以下公式计算。

1.3.3 样品中辣椒红素得率的测定

准确称取干燥辣椒红素粗品约0.01 g，精确至0.000 1 g，用丙酮稀释定容于10 mL容量瓶中，定容后不断振荡约10 min。精确吸取定容好的辣椒红素粗品溶液1 mL置于10 mL的容量瓶中定容，摇匀。用紫外分光光度计于460 nm处测定吸光值，丙酮作参比液，根据标准曲线得出粗制辣椒红素的浓度，再计算出其中的辣椒红素得率[16]，公式如下。

式中：X表示辣椒红素得率，%；m1表示辣椒红素质量，g；m2表示辣椒粉质量，g。

1.4 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和Origin 9.1软件进行数据处理和图表的制作。

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长及最佳有机溶剂的选择

辣椒红素主要由弱极性组分组成，而提取主要集中在对弱极性组分的研究。根据相似相溶原理，试验采用95%乙醇、正己烷、乙酸乙酯等有机溶剂作为提取试剂分别提取辣椒红素，测定不同波长下溶液吸光度，结果见图3。

图3 不同提取溶剂对辣椒红素吸光度的影响Fig.3 Influence of different extraction solvents on the absorbance of capsanthin

如图3所示，3种提取溶剂均在460 nm处有最大的吸光度，因此辣椒红素的最大吸收波长为460 nm。在此波长测定误差最小。

为考察不同提取溶剂对提取得到的辣椒红素的色价和得率的影响，以95%乙醇、正己烷和乙酸乙酯3种不同溶剂作为探讨对象，不同溶剂提取辣椒红素的色价和得率的试验结果见表1，不同提取溶剂提取辣椒红素粗提物见图4。

由表1和图4可知，95%乙醇提取液浑浊，提取得率为0.91%，高于正己烷和乙酸乙酯，但在460 nm处的色价却最低。提取液浑浊，是由于蛋白质及果胶等物质的存在导致色价降低。正己烷的滤液比乙酸乙酯滤液澄清，同时提取产物的色价和得率也优于乙酸乙酯，其色价和得率分别为49.4、0.85%。另一方面，在溶剂回收过程中，正己烷的沸点（68℃）相对较低，消耗的回收热能较少，因此最佳提取溶剂选择正己烷。

图4 不同提取溶剂提取辣椒红素粗提物Fig.4 Extraction of capsanthin extracted with different solvents

表1 不同溶剂提取辣椒红素的色价和得率Table 1 Color value and yield of capsanthin extracted with different solvents

2.2 有机溶剂法提取辣椒红素工艺优化

2.2.1 提取温度对辣椒红素提取效果影响研究

不同提取温度对辣椒红素提取的影响如图5所示。

图5 不同提取温度对辣椒红素色价和得率的影响Fig.5 Effect of different temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

由图5可知，辣椒红素的色价和得率随着温度的升高先升高后降低，当温度达到60℃时，色价和得率达到最大值，分别为68.20、1.23%，继续升温，其色价和得率开始下降。主要是因为提取过程中温度升高，分子运动速度加快使有机溶剂提取的辣椒红素增多。当温度持续升高，一些杂质也会溶解于有机溶剂中，导致辣椒红素的浓度降低，并且温度过高会导致辣椒红素的降解，性质改变，从而使辣椒红素的色价和得率降低。因此，辣椒红素的最佳提取温度为60℃。

2.2.2 提取时间对辣椒红素提取效果影响研究

不同时间处理对辣椒红素提取的影响如图6所示。

图6 不同提取时间对辣椒红素色价和得率的影响Fig.6 Effect of different time on the color value and yield of extracted capsanthin

由图6可知，辣椒红素的色价和得率随着提取时间的延长先上升后下降。当提取时间为3 h时，其色价和得率达到最高，分别为68.20、1.22%。3 h后随着提取时间的延长，其色价和得率开始下降。主要是因为随着时间的延长，辣椒红素逐渐溶解于提取液中，含量逐渐增加，浓度上升导致色价和得率提高。但当时间过长则会使其他物质慢慢溶解于溶液中，导致辣椒红素色价和得率降低。因此辣椒红素的最佳提取时间为3 h。

2.2.3 液料比对辣椒红素提取效果影响研究

不同液料比对辣椒红素提取的影响如图7所示。

图7 不同液料比对辣椒红素色价和得率的影响Fig.7 Effect of different ratio of material on the color value and yield of extracted capsanthin

由图7可知，辣椒红素的色价和得率随着液料比的升高呈现先上升后下降的趋势。当液料比为5∶1（mL/g）时，其色价和得率达到最高值，分别为53.73、0.97%。高于 5∶1（mL/g）时，辣椒红素的得率逐渐下降，色价降低。这种趋势主要是因为随液料比的增加，辣椒红素含量增加，提取液中其浓度也随之增加，使辣椒红素的色价和得率升高。液料比过大会引起其他杂质溶出干扰辣椒红素的纯度致使提取得到的辣椒红素的色价和得率下降。因此辣椒红素的最佳液料比选择5∶1（mL/g）。

2.3 超声辅助法提取辣椒红素工艺优化

2.3.1 超声时间对辣椒红素提取效果影响研究

在超声温度和液料比相同的条件下，研究超声时间对辣椒红素提取效果的影响，影响结果如图8所示。

图8 不同超声时间对辣椒红素色价和得率的影响Fig.8 Effect of different time on the color value and yield of extracted capsanthin

由图8可知，随着时间的延长，辣椒红素的色价和得率不断增大，在超声时间为60 min时，提取得到的辣椒红素的色价和得率达到最高，分别为83.77、1.54%；但继续延长超声时间，辣椒红素的色价和得率开始下降。主要因为一定的超声时间破坏了细胞壁，使辣椒红素更易于溶出；但超声时间过长会导致细胞内的辣椒红素凝集成团，使辣椒红素的溶出率降低，同时也会使辣椒红素发生降解。因此，超声提取辣椒红素的最佳提取时间为60 min。

2.3.2 超声温度对辣椒红素提取效果影响研究

在超声时间和液料比相同的条件下，研究超声温度对辣椒红素提取效果的影响，结果如图9所示。

图9 不同超声温度对辣椒红素色价和得率的影响Fig.9 Effect of different temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

由图9可知，超声温度为30℃～40℃时，提取得到的辣椒红素的色价和得率差距不大，辣椒红素的得率及色价随温度的升高而增大，在超声温度为50℃时达到最高，色价和得率分别为111.53、2.06%。温度继续升高，提取的辣椒红素的色价和得率呈下降趋势。主要因为适当的超声温度有助于辣椒红素的溶解；但当温度过高时，会导致溶剂的挥发从而使辣椒红素不能完全溶出。因此，超声提取辣椒红素的最佳温度为50℃。

2.3.3 液料比对辣椒红素提取效果影响研究

在超声时间和超声温度相同的条件下，液料比对辣椒红素提取效果的影响结果如图10所示。

图10 不同液料比对辣椒红素色价和得率的影响Fig.10 Effect of different ratio of material on the color value and yield of extracted capsanthin

由图10可知，随液料比的增大，辣椒红素的色价和得率先上升后下降，液料比为5∶1（mL/g）时色价和得率达到最高值，分别为110.21、2.01%，而当液料比高于5∶1（mL/g）时，辣椒红素的色价和得率下降。主要因为合适的液料比有利于辣椒红素的浸提，当加入的有机溶剂过多则会使其它杂质溶解，影响辣椒红素浓度。因此，超声提取辣椒红素的最佳液料比为5∶1（mL/g）。

2.4 酶法辅助提取辣椒红素工艺优化

2.4.1 酶添加量对辣椒红素提取效果影响研究

在酶解时间和酶解温度一定的条件下，酶添加量对辣椒红素提取效果影响结果如图11所示。

由图11可知，随着纤维素酶添加量的增大，提取得到的辣椒红素的色价和得率呈先上升后下降的趋势，在酶添加量为0.3%时，辣椒红素的色价和得率达到最高值，继续增加酶添加量辣椒红素的色价和得率慢慢下降。主要是因为在一定条件下，酶添加量低于最佳值时，酶解反应未进行完全，底物过量，致使辣椒红素色价不高，得到的辣椒红素也不多，达到最佳值时，酶解反应进行得比较彻底，而再增加酶添加量时影响不明显，呈现平缓趋势。因此，纤维素酶的最佳酶添加量为0.3%，在此条件下提取得到的辣椒红素的色价和得率分别为49.91、0.91%。

图11 酶添加量对辣椒红素色价和得率的影响Fig.11 Effect of enzyme dosage ratio on the color value and yield of extracted capsanthin

2.4.2 酶解温度对辣椒红素提取效果影响研究

在酶解时间和酶添加量一定的条件下，酶解温度对辣椒红素提取效果影响结果如图12所示。

由图12可知，纤维素酶酶解温度在25℃～35℃时，辣椒红素色价和得率随酶解温度增加而增大，在35℃时达到最大值，提取得到的辣椒红素的色价和得率分别为42.13、0.76%，35℃后随酶解温度的增大而急剧下降。主要是因为一定的酶解温度可以加速酶解反应，但当温度过高时则会促使酶活性变性，影响辣椒红素的提取效果。因此，纤维素酶最佳酶解温度是35℃。

图12 酶解温度对辣椒红素色价和得率的影响Fig.12 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the color value and yield of extracted capsanthin

2.4.3 酶解时间对辣椒红素提取效果影响

在酶添加量和酶解温度一定的条件下，酶解时间对辣椒红素提取效果影响结果如图13所示。

图13 酶解时间对辣椒红素色价和得率的影响Fig.13 Effect of enzymatic hydrolysis time on the color value and yield of extracted capsanthin

由图13可知，纤维素酶提取得到的辣椒红素的色价和得率随酶解时间的增加先升高后降低，3 h时达到最大值，3 h后开始下降。主要是因为在一定时间内，酶活力得到了充分利用，使酶解反应进行得比较完全，但当酶解时间过长，会造成一部分的辣椒红素分解。因此，纤维素酶最佳酶解时间是3 h。

2.5 亚临界流体萃取辣椒红素

亚临界流体萃取对极性物质具有强的溶解能力，同时扩散系数大、黏度系数小，在液态和临界点附近具有良好的溶解性能。亚临界流体萃取辣椒红素结果见表2。

表2 亚临界流体萃取辣椒红素的色价和得率Table 2 Color value and yield of subcritical fluid extraction of capsanthin

由表2可知，萃取剂为正丁烷、萃取温度45℃、萃取压力 0.38 MPa、液料比 8∶1（mL/g）、萃取时间 1 h 的萃取条件下，辣椒红素的色价和得率分别为124.26，2.23%，与其它3种方法相比，亚临界流体的色价和得率最高。主要是因为亚临界流体萃取保留了有效成分的营养价值，从而提高了有效成分的提取率。

2.6 不同提取工艺对辣椒红素得率和色价的影响及比较

不同提取工艺获得辣椒红素得率和色价结果比较见表3。

从表3可知，4种提取工艺提取得到的辣椒红素的色价和得率有一定差异性，其中亚临界流体萃取得到的辣椒红素的色价和得率最高，分别为124.26，2.23%。这是由于亚临界流体萃取技术充分利用亚临界状态正丁烷分子与辣椒粉发生的分子扩散作用，萃取辣椒红素相对完全，同时该过程在室温25℃或低温条件下进行，避免物料中的热敏性成分破坏。超声波辅助加快了辣椒红素在溶剂中的扩散作用，最大限度破坏细胞壁将辣椒红素溶出。相比较传统有机溶剂法和纤维素酶辅助，亚临界流体萃取和超声波辅助法提取效率更高，提取得到的辣椒红素色价更高。考虑到实际生产成本，超声波辅助提取工艺更加符合辣椒红素产业化生产的需求。

表3 不同提取工艺获得辣椒红素色价和得率结果比较Table 3 Comparison of different extraction conditions on the color value and yieldof extracted capsanthin

3 结论

本文通过有机溶剂法、超声辅助法、酶提取法、亚临界流体萃取法4种提取方法提取辣椒红素，并对4种提取方法提取得到的色价和得率进行了比较。结果表明，亚临界流体萃取法和超声辅助提取法提取效果要优于有机溶剂法和酶辅助提取工艺，其色价分别为124.26和113.20，得率分别为2.23%和2.06%，这是由于亚临界流体萃取充分利用亚临界状态正丁烷分子与辣椒粉发生的分子扩散作用，使辣椒红素萃取得相对完全，同时该过程在室温25℃或低温条件下进行，避免物料中的热敏性成分破坏。超声波辅助加快了辣椒红素在溶剂中的扩散作用，最大限度地破坏细胞壁使辣椒红素溶出。考虑到实际生产设备及成本，超声波辅助提取工艺更加符合辣椒红素产业化生产。