不同酚羟基数目羟基苯甲酸的复合对壳聚糖膜性能的影响

杨林杰，周闯，杨子明，王超，何祖宇，刘运浩，于丽娟，屈云慧，李普旺

（1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉 430072）（2.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所，广东湛江 524091）（3.云南省农业科学院农产品加工研究所，云南昆明 650000）

随着“健康中国”理念的发展，人们对于绿色有机、健康安全的食品需求越来越大，对食品包装材料的研究也进入到了新的阶段，具有绿色、可持续发展的新型包装制品及材料成为学者们研究的热点。可食性包装膜是以天然可食性物质（如壳聚糖、淀粉、明胶等）为原料，通过不同分子间相互作用而形成的具有多孔网络结构的薄膜，可以用来隔离微生物和外来污染物的进入，防止食品变质，具有一定的保鲜作用[1]。

壳聚糖（Chitosan，CS）是天然多糖甲壳素脱去部分乙酰基团的产物，具有安全无毒、生物降解性和成膜性等特点，广泛应用于食品、农业及环保等领域[2,3]。然而，壳聚糖膜在食品工业中的应用受到其低抗氧化活性和易溶胀性的限制[4]。因此，向壳聚糖膜中加入生物活性物质是改善其性能的可行方法。迄今为止，研究人员已经通过添加生物活性物质，如精油、植物提取物及酚类化合物等，开发了许多基于壳聚糖的共混复合膜[5]。在不同种类的生物活性物质中，多酚类化合物作为植物界最丰富的次生代谢产物，常被选择与壳聚糖共混以增强其性能[6]。酚酸作为酚类化合物的一个重要类别，具有优异的抗氧化活性，根据其结构还可以进一步分为羟基苯甲酸和羟基肉桂酸两类[7]。近年来，研究人员致力将酚酸与壳聚糖共混来改善成膜后的性能。Sun等[8]将没食子酸添加到壳聚糖膜中，结果表明，没食子酸的加入可以有效改善壳聚糖膜的机械性能，使其拉伸强度增强约70%。还通过降低壳聚糖膜水蒸气透过率（约10%），以增强其气体阻隔性能。Liu等[9]将对香豆酸与壳聚糖混合制备可食用膜，研究结果表明，低含量对香豆酸的加入（0.5%或1%，m/V）增强了复合膜的拉伸强度（约25%）和水蒸气阻隔性能，并且在水性和脂肪性食品模拟物中显示出较好的抗氧化能力。此外还有研究发现，没食子酸-壳聚糖复合膜的优异性能，可能是由于其分子中三个酚羟基所导致的[10]。但是，对比不同酚羟基数目的羟基苯甲酸对壳聚糖膜性能的研究目前还比较少见。

本研究将水杨酸、原儿茶酸、龙胆酸和没食子酸与壳聚糖共混制备成复合薄膜，探讨不同酚羟基数目的羟基苯甲酸对壳聚糖膜流变学和理化性质的影响，为壳聚糖薄膜在食品包装领域的研究和应用提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖（脱乙酰度：≥95%，粘度＜200 mPa·s）、龙胆酸，上海麦克林生化科技有限公司；水杨酸、原儿茶酸、没食子酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙酸、丙三醇，AR，西陇科学股份有限公司。

Thermofisher/MARS哈克流变仪，美国TA公司；756S紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；Mettler TGA/DSC3+热重分析仪，梅特勒托利多科技有限公司；UTM6503电子万能试验机，深圳三思纵横科技股份有限公司；捷克TESCAN MIRA LMS场发射扫描电镜，捷克TESCAN公司；PerkinElmer Spectrum 3傅立叶变换红外光谱仪，珀金埃尔默仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的制备

参照Liu等[10]方法制备羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜。首先，将1 g壳聚糖溶于50 mL的1%（V/V）乙酸溶液中，于室温下搅拌过夜。然后向壳聚糖溶液中加入0.6 mL甘油和0.5 g水杨酸，室温搅拌1 h，再将得到的成膜溶液置于功率200 W，频率40 kHz的条件下超声脱气30 min。最后将成膜溶液浇铸在有机玻璃板上（12 cm×12 cm），室温干燥48 h后从面板上将复合膜剥离，得到水杨酸-壳聚糖复合膜（SA-CS），并在测试前置于温度为25 ℃，相对湿度为50%条件下的恒温恒湿箱中至少48 h以平衡薄膜的水分。以相同的方法制备原儿茶酸-壳聚糖复合膜（PA-CS），龙胆酸-壳聚糖复合膜（GTA-CS），没食子酸-壳聚糖（GA-CS）和未添加羟基苯甲酸的纯壳聚糖膜（CS Film）作为对照组。

1.2.2 剪切速率对成膜溶液黏度的影响

参照等Wu等[11]的方法，在25 ℃下，使用旋转流变仪的平板-锥系统测定添加不同羟基苯甲酸的膜液在剪切速率为0～300 s-1范围内的黏度变化，得到成膜溶液黏度随剪切速率变化曲线。锥板直径为40 mm，角度为1 °。

1.2.3 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的物理性能和机械性能

1.2.3.1 复合膜厚度测定

在复合膜上随机取十个点，使用千分尺分别测量膜的厚度，精确到0.001 mm。以十个数值的平均值代表复合膜厚度。

1.2.3.2 复合膜透光率和不透明度测定

参照Tan等[12]方法，使用紫外可见分光光度计测定复合膜的透光率。将样品薄膜裁剪成矩形条状（10 mm×40 mm）置于比色皿中，以空的比色皿作为空白，于200～800 nm波长范围内测量样品的透射率。

薄膜的不透明度是基于复合膜在600 nm处的吸光度，通过以下公式（1）计算得出[13]。

式中：

OP——复合膜的不透明度（A600/mm）；

A——复合膜在600 nm处的吸光度；

d——复合膜的厚度，mm。

1.2.3.3 复合膜水蒸气透过率测定

参照Zhang等[14]方法测定复合膜水蒸气透过率。将复合膜裁剪并密封在装有3 g无水氯化钙的铝盒盒口，复合膜与铝盒的界面用石蜡密封。然后将铝盒置于装有蒸馏水的干燥器中（25 ℃，相对湿度100%），连续3 d每隔12 h称质量一次，按照公式（2）计算水蒸气透过率。

式中：

WVP——复合膜的水蒸气透过率，g/m·h·Pa；

ΔW——铝盒增加的质量，g；

d——复合膜的厚度，m；

S——复合膜的有效面积，m2；

t——铝盒重量增加的时间，h；

ΔP——复合膜两侧的蒸气压差，Pa。

1.2.3.4 复合膜热力学性能分析

称取5 mg薄膜样品于密封铝盒中，在氮气氛围下以10 ℃/min的升温速率从30 ℃加热到800 ℃。氮气流速设定为20 mL/min。

1.2.3.5 复合膜机械性能测定

参照Liu等[15]方法测定复合膜的机械性能并稍作修改。将复合膜裁剪成10 mm×100 mm的矩形条状，安装在电子万能试验机上，测试其力学性能。智能拉伸试验机初始夹具设为50 mm，拉伸速率设为50 mm/min。

1.2.4 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的结构表征

1.2.4.1 微观结构分析

通过场发射扫描电子显微镜观察复合膜的表观形貌，同时使用液氮脆断复合膜样品，以进行横截面观察[16]。

1.2.4.2 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析

将复合膜样品剪裁成10 mm×10 mm大小，以空气作为背景，在4 000～400 cm-1的波长下测量。红外光谱分辨率为4 cm-1。

1.2.5 复合膜总酚释放量及DPPH自由基清除率测定

复合膜总酚释放量的测定采用Folin-Ciocalteu法测定[17]。将50 mg复合膜样品置于5 mL去离子水中浸泡24 h，然后取1 mL上清液，与1 mL福林酚试剂混合均匀后，避光反应5 min。再加入5 mL质量分数为20%的Na2CO3溶液，室温避光反应2 h后，使用紫外分光光度计于760 nm波长处测定样品吸光度。此外，各羟基苯甲酸的标准曲线按照上述方法建立，根据标准曲线计算出复合膜的总酚释放量。

复合膜DPPH自由基清除率参照Ferreira等[18]方法测定。将0.1 mL上述上清液，与5 mL，100 μmol/L的DPPH乙醇溶液混合，室温避光反应30 min后，于517 nm波长处测定样品吸光度，按照公式（3）计算。

式中：

C——复合膜的DPPH自由基清除率，%；

A0——空白吸光度，%；

A1——样品吸光度，%。

1.3 数据统计分析

每组实验均重复三次，数值表示为平均值±标准差（Standard Deviation，SD）。通过SPSS 27，使用Duncan检验和单因素方差分析（ANOVA）进行多组间比较，如果P＜0.05则认为统计学上存在显著差异。

2 结果与讨论

2.1 剪切速率对成膜溶液黏度的影响

图1显示了不同羟基苯甲酸与壳聚糖成膜溶液的黏度随剪切速率的变化。相关研究表明，若溶液的黏度与剪切速率成负相关关系，则证明溶液具有假塑性流体性质或存在剪切稀化区域[19]。产生这种现象的主要原因是长链高分子溶液在静止或低剪切速率所形成平衡状态的网络结构，随剪切速率的增大而被破坏[20]。而剪切稀化现象可以说明成膜溶液拥有较好的铺展性[21]。如图1所示，所有成膜溶液都具有明显的剪切稀化区域，且与壳聚糖溶液相比，添加羟基苯甲酸后，各成膜溶液黏度均有所增加。这与王晓敏等[22]在茶多酚低负载量情况下，成膜溶液黏度变化情况相似。本研究结果可能是由于羟基苯甲酸交联壳聚糖，形成新的分子间氢键，也可能是羟基苯甲酸自身形成了酚二聚体或三聚体，而导致成膜溶液黏度增大。

图1 复合膜液的黏度与剪切速率关系Fig.1 Relationship between viscosity and shear rate of composite film fluid

2.2 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的物理性能和机械性能

2.2.1 透光透气性能

当薄膜包装食品暴露于紫外线下时，容易被氧化而导致食品出现变色、营养流失等不良影响。因此，膜对紫外线的阻隔性能是一项重要的参数。由图2可知，CS膜在200～800 nm范围内表现出最高的紫外线透过率，因此其紫外线阻隔性能较差。而羟基苯甲酸的加入显著降低了复合膜的紫外透过率，在200～320 nm范围内，其紫外透光率几乎为零，这可能是由于羟基苯甲酸中芳香基团吸收紫外线引起的。实验结果也与Limpisophon等[23]在没食子酸和明胶复合膜中观察到紫外透光率下降相同。

图2 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的透光特性Fig.2 Light transmittance of hydroxybenzoic acid-chitosan composite film

由表1可知，复合膜厚度从0.069 mm到0.077 mm不等，与CS膜相比，均有较大增加（P＜0.05），表明多酚类物质的负载会对壳聚糖膜厚度会产生影响，这与Peng等[24]研究结果类似。同时，复合膜的不透明度从1.11（A600/mm）到2.29（A600/mm）不等，相比CS膜也有显著性提高（P＜0.05）。

表1 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的物理和光学性能Table 1 Physical and optical properties of hydroxybenzoate-chitosan composite films

水蒸气透过率是评价包装材料阻隔性能的另一重要参数，拥有优异水蒸气阻隔性能的薄膜，能够有效保持新鲜食品的水分，更好的应用于食品保鲜领域[25]。复合膜的水蒸气阻隔性能见表1，添加羟基苯甲酸的复合膜相比CS膜显示出较低的水蒸气透过率（P＜0.05），分别为1.77×10-9、1.63×10-9、1.64×10-9和1.50×10-9g/(m·h·Pa)，原因可能是羟基苯甲酸含有的丰富酚羟基和壳聚糖之间形成氢键，从而限制了壳聚糖本身亲水基团亲和力。本研究表明，拥有三个酚羟基的GA，成膜后水蒸气透过率最低，为1.50×10-9g/(m·h·Pa)，明显优于其他复合膜（P＜0.05）。这与Sun等[26]所制备的苹果多酚-壳聚糖复合膜的性能保持一致。

2.2.2 热力学性能

热重分析是研究复合包装材料热稳定性的重要技术之一。复合膜的TG和DTG曲线如图3所示，薄膜样品在受热过程中（低于150 ℃）首先因为水分的流失而导致重量下降。从TG图中可知，CS膜损失了20%左右的水分，而添加羟基苯甲酸后，复合膜损失了约10%的水分。说明羟基苯甲酸的加入有助于提高CS膜的持水性。从薄膜样品达到最大失重率时的温度可以得知，羟基苯甲酸的加入有助于提高CS膜的热稳定性，其中GA-CS膜达到最大失重率时所需温度最高，为231 ℃。这可能是因为GA与CS形成更强的分子间氢键，从而加强了复合膜分子间作用力，使其稳定性增强。Kaczmarek等[27]也得到了与本文相似的研究结果。

图3 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的热力学性质Fig.3 Thermodynamic properties of hydroxybenzoic acid-chitosan composite films

2.2.3 机械性能

在食品运输和包装加工中，良好的机械强度能够确保复合膜结构的完整性和阻隔性不被破坏。拉伸强度和断裂伸长率则是反映复合膜机械性能的两个关键指标[28]。由图4a可以看出，除SA-CS以外，羟基苯甲酸的加入使复合膜的拉伸强度可以从11.27 MPa增长至23.22 MPa，其中GA加入后效果最佳（P＜0.05）。而SA-CS的结果与之相反，添加SA后，复合膜拉伸强度反而下降至9.45 MPa。这可能是由于SA的加入在一定程度上干扰CS分子链与链的相互作用，削弱了分子间相互作用力，从而降低了CS膜的力学性能。但对于PA、GTA和GA而言，根据其流变学以及FT-IR分析，可能是因为其分子中丰富的酚羟基与CS交联所形成的分子间氢键，弥补了对CS结构的轻度损伤，甚至可以增强复合膜中分子间作用力，使其力学性能有一定提高。

图4b是复合膜的应力应变曲线，从图中可知，CS膜、SA-CS、PA-CS和GTA-CS复合膜在经过屈服点后都出现了应变增强现象，这可能是因为在拉伸过程中材料体积不变，但是横截面积发生收缩，使分子链之间变得更加紧凑，出现新的物理交联，从而在曲线中体现出应变增强。其中SA-CS的杨氏模量（弹性形变阶段曲线的斜率）明显小于其他样品，说明SA-CS在拉伸过程中更易发生形变，这可能是其断裂伸长率增大的原因。而GA-CS在形变初期应力突增，可能是因为其分子中羟基数目最多，更易与CS交联形成分子间氢键，进而使分子间作用力增强，使在形变初期出现应力突增的现象。而后出现的应变软化，则可能是在弹性形变阶段，GA-CS抵抗进一步形变的相互作用力已经被克服，链与链之间变得更加容易脱离，因此加快了形变的速度。这也可以从GA-CS复合膜具有最低的断裂伸长率得到解释。

2.3 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜结构表征

2.3.1 复合膜微观结构分析

扫描电子显微镜图像（SEM）可以提供薄膜表面和内部微观结构的详细信息，有助于建立膜微观结构和宏观性质之间的关系[29]。复合膜的SEM如图5所示，可以看出CS膜表面和截面都平整光滑且结构紧密，没有孔洞和裂纹。添加羟基苯甲酸后的复合膜表面虽有少数颗粒不均匀分布，但整体比较光滑，其截面形貌也与CS膜相同，无明显缺陷，证明壳聚糖、羟基苯甲酸和甘油有良好的相容性，在体系中分布均匀。这说明羟基苯甲酸通过氢键、范德华力、疏水相互作用等作用力均匀分布于成膜基质中，分子间交联紧密，有助于形成稳定有序的膜结构。但在GA-CS截面中观察到不规则的、波纹状的褶皱，这可能与其较低的断裂伸长率有所联系。

图5 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜表面（左）和横截面（右）的微观结构图Fig.5 SEM micrographs of the surface (on the left) and cross-section (on the right) of the composite films

2.3.2 FT-IR分析

FT-IR可用于分析添加羟基苯甲酸前后成膜材料特征基团的变化情况。如图6所示，在CS膜中，由于壳聚糖结构中O-H和N-H的伸缩振动，在3 280 cm-1处出现特征吸收峰。而2 920 cm-1和2 876 cm-1处的特征峰是壳聚糖结构中C-H对称伸缩振动和非对称伸缩振动。1 641 cm-1以及1 554 cm-1处的峰分别归因于C=O拉伸振动（酰胺I）和N-H弯曲振动（酰胺II）。而1 030 cm-1处的峰则对应于壳聚糖和甘油结构中的C-C和C-O键的伸缩振动。与CS膜相比，复合膜在3 500到3 100 cm-1之间吸收峰变的更宽，表明羟基苯甲酸与壳聚糖之间存在较强氢键作用。此外，复合膜成膜溶液的流变学分析也可以证明氢键的存在。而复合膜分别在1 640～1 609、1 382～1 340、762～793 cm-1范围内出现了芳香环骨架结构的特征吸收峰，也进一步证实了复合膜中羟基苯甲酸的存在。除上述芳香环特殊吸收峰以外，红外图谱中没有明显新峰出现，说明羟基苯甲酸与壳聚糖之间没有共价键形成。该结果与Liu等[9]研究结果一致。

图6 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的FT-IR图Fig.6 FT-IR spectra of hydroxybenzoic acid-chitosan composite films

2.4 复合膜总酚释放量及DPPH自由基清除率

复合膜的总酚释放量及DPPH自由基清除率见图7，4种羟基苯甲酸复合膜中，SA-CS的总酚释放量（74.35 mg/g）远高于其他薄膜，这可能因为SA分子结构仅含1个酚羟基，和壳聚糖之间相互作用力较弱，有利于复合膜中多酚的释放。在自由基清除率方面，羟基苯甲酸的抗氧化活性与分子中酚羟基的含量和分布密切相关[30]。与总酚释放量的结果相反，PA-CS、GTA-CS和GA-CS复合膜的自由基清除能力都显著高于SA-CS和CS膜（P＜0.05），这主要由于PA、GTA和GA的结构中具有多个酚羟基，有助于提高复合膜的抗氧化活性，且GA-CS的DPPH自由基清除率最高，为71.85%，也证实了羟基苯甲酸/壳聚糖复合膜的抗氧化活性与分子中酚羟基的数目呈正相关。Hu等[31]研究结果也表明，加入绿原酸后CS膜的抗氧化活性有显著提高。

图7 羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜的总酚释放量和抗氧化活性Fig.7 Total phenol release and antioxidant activity of hydroxybenzoic acid-chitosan composite films

3 结论

本研究制备了四种不同羟基苯甲酸-壳聚糖复合膜。成膜溶液流变学分析显示，负载羟基苯甲酸后膜液黏度变大，浇铸成膜后其透光率显著下降，表明复合膜的抗紫外线能力增强，且成膜后的热稳定性、气体阻隔性、机械性能以及抗氧化活性相比CS膜都有明显提升，其中GA-CS综合性能指标最佳。通过SEM对复合膜进行微观形貌分析可知，复合膜微观结构均匀且紧密，无明显裂纹，表明壳聚糖与羟基苯甲酸具有良好的生物相容性。FT-IR图谱显示，羟基苯甲酸与壳聚糖之间存在氢键作用，表明壳聚糖与羟基苯甲酸具有较强的分子作用力，有利于提高复合膜的力学性能。综上所述，羟基苯甲酸中酚羟基的数目对CS膜的性能有显著影响，在实现可食用膜的性能改善方面具有一定的指导作用。