体外法研究泡叶藻和羊栖菜对高精料下湖羊瘤胃发酵参数的影响

沈 奔，陈 敏，韩 宇，严啊妮，赵秀娟，施春伟，王洪荣

（1.扬州大学动物科学与技术学院, 江苏 扬州 225009；2.海门区海门港新区农业农村和社会事业局, 江苏 南通 226100；3.南通科技职业学院，江苏 南通 226007）

随着我国畜牧业的快速发展，规模化与集约化生产已成为畜牧业现代化的主要标志。当前，我国多数中、小养殖场为了提高牛羊的生产效率，常饲喂以谷物淀粉为主的高精料饲粮，这种饲养模式在提高动物生产效率的同时，也易导致反刍动物瘤胃液pH 快速下降，并伴随出现以亚急性瘤胃酸中毒(Sub-acute ruminal acidosis，SARA)为主的营养代谢疾病[1]。研究表明，SARA 可引起反刍动物瘤胃上皮损伤、腹泻、肝脏脓肿、跛行等病症，增加反刍动物消化道中的细菌毒素浓度，最终导致其采食量和产奶量下降[2]。在生产环节中，饲料品质差或饲养管理不善也会造成上述病症。因此，针对反刍家畜SARA，预防比治疗更为重要[3-4]。

海藻含有丰富的生物活性物质，其具有免疫调节、抗氧化、抗病毒及抗心血管疾病等功能。研究表明，海藻油可抑制牛链球菌的丰度，减少乳酸在瘤胃内的快速堆积[5]。Cruywagen 等[6]试验发现，在奶牛高精料饲粮中添加钙质海藻可有效降低瘤胃液中的乳酸浓度，提高乙酸和总挥发性脂肪酸的浓度，从而改善瘤胃发酵模式，缓解瘤胃代谢性酸中毒。泡叶藻(Ascophyllum nodosum)富含岩藻多糖，可提高机体的抗氧化能力，而泡叶藻硫酸多糖可改善肠道菌群失调和肠道炎症[7-8]。羊栖菜(Sargassum fusiforme)是生长于沿海低潮带岩石上的藻类植物，富含可溶于水的酸性多糖，包括褐藻胶、褐藻多糖硫酸脂以及褐藻淀粉等，具有较强生物活性[9]。研究发现，羊栖菜中带有聚阴离子的多糖可通过抑制有害菌的相对丰度、提高有益菌的相对丰度来改善瘤胃内环境，调节机体代谢[10]。目前，国内外关于泡叶藻和羊栖菜对反刍动物瘤胃发酵的相关报道较少。因此，本研究选取3 只体重相近且安装有永久性瘤胃瘘管的健康湖羊作为体外发酵瘤胃液的供体，利用体外模拟瘤胃发酵技术，探究不同添加水平下，泡叶藻和羊栖菜对高精料日粮体外发酵参数的影响，筛选出缓解瘤胃酸中毒的适宜添加量，以期为泡叶藻和羊栖菜在反刍动物健康养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选取3 只(59 ± 1.5) kg，体况相近、健康且装有永久性瘤胃瘘管的雄性湖羊为本次试验发酵液的供体，湖羊的饲粮组成及营养水平如表1 所示。每日07:00 和19:00 各饲喂1 次，自由采食和饮水。

1.2 试验设计

试验采用单因素随机试验设计，在高精料底物(精粗比70 ꞉ 30)中添加泡叶藻和羊栖菜，泡叶藻和羊栖菜分别购自西安万方生物有限公司和温州市洞头北岙深海巴巴养殖场。发酵底物为玉米0.49 g、豆粕0.21 g、燕麦0.15 g、苜蓿0.15 g，共1.00 g (营养水平：ME，10.36 MJ·kg-1；CP，16.65%；NDF，26.00%；ADF，16.14%；Ca，0.31%；P，0.33%)。本试验设计5 种添加剂量0 (对照组)、1%、2%、3%、4% (干物质基础)，每组设置3 个重复。分别于发酵后的6、9、12 和24 h，采集发酵液用于各发酵参数的测定。泡叶藻0 (对照组)、1%、2%、3%、4%添加组分别命名为ASC0、ASC1、ASC2、ASC3、ASC4；羊栖菜0 (对照组)、1%、2%、3%、4%添加组分别命名为SAR0、SAR1、SAR2、SAR3、SAR4。

1.3 体外发酵试验方法

于晨饲前进行瘤胃液的采集，分别于瘤胃前、中、后3 个部位采集瘤胃液，混匀经4 层纱布过滤至提前预热(39 ℃)且充满二氧化碳(CO2)的保温瓶中，带回实验室后放入39 ℃恒温水浴锅保温并持续通入CO2以保证厌氧状态。人工唾液盐参照Menke 等[11]的方法配制；充分混匀后放入39 ℃恒温水浴锅中并持续通入CO2，按照瘤胃液与人工唾液1 ꞉ 2 的比例混合均匀，取60 mL 分装至装有底物的120 mL 培养瓶中(持续充入CO2保持厌氧环境)，分装完毕后，用橡胶塞和铝盖将发酵瓶密封并迅速置于39 ℃恒温振荡水浴摇床，以125 r·min-1的速度持续振荡培养6、9、12 和24 h。达到各时间点后，将培养瓶取出并置于冰水浴以结束发酵，取出发酵液测定pH，并将其分装置于-20 ℃保存，用于挥发性脂肪酸(VFA)、乳酸、氨态氮(NH3-N)和微生物蛋白(MCP)含量的测定。

1.4 指标测定与方法

发酵液pH 的测定使用FE20 型pH 计于采样后立即测定；VFA 使用Erwin 等[12]的方法测定；乳酸浓度使用对羟基联苯法[13]测定；NH3-N 的浓度使用酚-次氯酸钠比色法[14]测定；MCP 的浓度使用嘌呤法[15]测定。

1.5 数据处理

试验数据经Excel 2010 整理，通过SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan 法进行多重比较，采用一般线性模型对发酵终点的pH、NH3-N、MCP、乳酸和VFA 进行方差分析，并采用Tukey 法进行多重比较。通过正交多项式矩阵检测它们的一次和二次效性。结果以平均值和总标准误(SEM)表示，在0.05 水平上进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液pH 的影响

随着发酵时间的延长，发酵液的pH 逐渐降低，在发酵24 h 时pH 降到最低。ASC3和ASC4组在发酵各时间点pH 显著高于ASC0组(P< 0.05)；随着泡叶藻添加量的提高，6 和9 h 发酵液pH 呈线性升高趋势(P< 0.05)，12 和24 h 时呈现出显著的二次效应(P< 0.05)。SAR3组pH 在发酵发酵各时间点显著高于SAR0组(P< 0.05)；在发酵各时间点，发酵液pH 随着羊栖菜添加量的提高呈线性升高趋势(P< 0.05) (表2)。

表2 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液pH 的影响Table 2 Effects of Ascophyllum nodosum and Sargassum fusiforme supplementation on pH of fermentation in vitro

2.2 ASC 和SAR 对体外发酵液NH3-N 浓度和MCP 浓度的影响

ASC3组NH3-N 浓 度 在 发 酵9、12 和24 h 时 显著低于ASC0组(P< 0.05)；随着泡叶藻添加量的提高，发酵液NH3-N 浓度在发酵12 和24 h 时呈线性降 低 趋 势(P< 0.05)。SAR3组NH3-N 浓 度 在 发 酵12 和24 h 时显著低于SAR0组(P< 0.05)；随着羊栖菜添加量的提高，24 h 发酵液NH3-N 浓度呈线性增加趋势(P< 0.05) (表3)。

表3 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液NH3-N 浓度的影响Table 3 Effects of Ascophyllum nodosum and Sargassum fusiforme supplementation on NH3-N concentration of fermentation in vitro mg·dL-1

ASC3组MCP 浓度在发酵各个时间点均显著高于ASC0组(P< 0.05)；泡叶藻各添加组发酵液MCP 浓度在发酵各个时间点均呈现出显著二次效应(P< 0.05)。羊栖菜各添加组MCP 浓度在发酵9 和12 h 时显著高于ASC0组(P< 0.05)；发酵24 h时，SAR3组MCP 浓度显著高于SAR0组(P< 0.05)；在发酵9、12 和24 h 时发酵液MCP 浓度随着羊栖菜添加量的提高呈显著线性关系(P< 0.05) (表4)。

表4 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液微生物蛋白含量的影响Table 4 Effects of Ascophyllum nodosum and Sargassum fusiforme supplementation on microbial protein(MCP) concentration of fermentation in vitro mg·mL-1

2.3 ASC 和SAR 对体外发酵液乳酸浓度的影响

ASC1组 和ASC3组 乳 酸 浓 度 在 发 酵12 h 时 显著低于ASC0组(P< 0.05)；各添加组乳酸浓度在发酵24 h 时均显著低于ASC0组(P< 0.05)；在发酵9、12 和24 h 时随着泡叶藻添加量的提高各添加组乳酸浓度呈现显著二次效应(P< 0.05) (图1)。

图1 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液乳酸浓度的影响Figure 1 Effects of Ascophyllum nodosum and Sargassum fusiforme supplementation on the lactic acid concentration of fermentation in vitro

羊栖菜各添加组乳酸浓度在发酵24 h 时均显著低于SAR0组(P< 0.05)，乳酸浓度随着羊栖菜添加量的提高呈现显著的线性关系(P< 0.05) (图1)。

2.4 ASC 和SAR 对体外发酵液VFA 比例及浓度的影响

各添加组发酵液中乙酸的均随发酵时间的延长呈现升高趋势(图2)。ASC4组发酵液乙酸比例在发酵9、12 和24 h 时均显著高于ASC0组(P< 0.05)，丙酸比例均显著低于ASC0组(P< 0.05)。ASC3组和ASC4组发酵液乙酸/丙酸在发酵各时间点均显著高于ASC0组(P< 0.05)；发酵液乙酸比例、丙酸比例和乙酸/丙酸在发酵各时间点随着泡叶藻添加量的提升呈现显著线性关系(P< 0.05)。ASC4组发酵液丁酸比例在发酵24 h 时显著低于ASC0组(P< 0.05)。随着发酵的进行，体外发酵液总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid, FA) 浓度逐渐增加，ASC0组体外发酵液TVFA 浓度均低于其余各添加组。ASC3组和ASC4组发酵液TVFA浓度在发酵24 h 时均显著高于ASC0组(P< 0.05)。

图2 泡叶藻对体外发酵液挥发性脂肪酸比例及浓度的影响Figure 2 Effects of Ascophyllum nodosum supplementation on the ratio and concentration of volatile fatty acid(VFA) in fermentation in vitro

SAR4组发酵液乙酸比例在发酵12 和24 h 时均显著高于SAR0组(P< 0.05) (图3)；SAR2、SAR3和SAR4组发酵液丙酸比例在发酵9 h 时均显著低于SAR0组(P< 0.05)。SAR4组酵液乙丙比在发酵12 h时显著升高(P< 0.05)，各添加组发酵液乙酸/丙酸比在发酵24 h 时均显著升高(P< 0.05)且呈现出显著二次效应(P< 0.05)。SAR4组发酵液丁酸比例在发酵12 和24 h 时均显著低于SAR0组(P< 0.05) 。随着发酵的进行，体外发酵液TVFA 浓度逐渐增加，SAR0组的体外发酵液TVFA 浓度均低于其他各组。SAR3组发酵液TVFA 浓度显著在发酵各时间点均显著高于SAR0组(P< 0.05) 。

图3 羊栖菜对体外发酵液挥发性脂肪酸比例及浓度的影响Figure 3 Effects of Sargassum fusiforme supplementation on the ratio and concentration of VFA in fermentation in vitro

3 讨论

3.1 ASC 和SAR 对体外发酵液pH 的影响

瘤胃液pH 是衡量瘤胃健康以及维持瘤胃正常发酵的重要指标之一，影响瘤胃液pH 的因素有饲粮种类及精粗比、唾液分泌量、瘤胃内乳酸及有机酸生成、吸收和排出速度等[16]。正常情况下，反刍动物瘤胃液pH 维持在6.5 左右，若长期饲喂大量谷类等易于发酵的碳水化合物饲料，使短链脂肪酸和乳酸在瘤胃中积累，致使pH 降至5.2～5.6，并诱发SARA[1,17]。本研究结果表明，发酵24 h 时，对照组发酵液pH 处于5.2～5.6，这说明体外SARA 诱导成功。发酵的各个时间点，ASC3组发酵液pH 显著高于ASC0组，这与Alejandro 等[18]研究结果一致。各个发酵采样时间点，SAR3组的发酵液pH 均显著高于SAR0组。Boeckaert 等[19]试验发现，饲粮中添加微藻可显著降低奶牛瘤胃挥发性脂肪酸的浓度，提高瘤胃pH；此外泡叶藻和羊栖菜均富含膳食纤维，这可促进反刍动物唾液的分泌，增加反刍的次数，从而减缓瘤胃pH 的下降[20]。值得注意的是，本研究中添加3%的泡叶藻和羊栖菜后，体外发酵液中TVFA 浓度显著上升，此时pH 并未显现出降低的趋势，反而显著上升，这可能是由于在添加两种海藻之后，发酵液中乳酸浓度显著降低，而乳酸对瘤胃pH 的贡献率为TVFA 的近10 倍[21]；其次海藻在发酵瓶内形成的碱性氧化物以及藻内抑菌物质发挥作用都有可能缓解了pH 的降低[20]，但具体机制还需要进一步试验证明。本研究说明高精料饲粮中添加3% ASC 或SAR 可有效缓解瘤胃pH 的降低，进而改善瘤胃SARA。

3.2 ASC 和SAR 对体外发酵液NH3-N 浓度和MCP 浓度的影响

瘤胃微生物利用饲料蛋白降解的NH3-N 为氮源合成MCP，因此，瘤胃液NH3-N 浓度可反映瘤胃微生物对氮的利用情况[22]。褐藻是唯一一种能够在体内积攒褐藻多酚(phlorotannins)的海藻，多酚可改善瘤胃发酵，提高蛋白质代谢率、降低甲烷产生[23]。熊颖[24]研究表明，0.3%板栗总苞多酚可显著降低体外发酵液中NH3-N 的浓度，提高MCP 的含量。本研究中，泡叶藻组和羊栖菜组发酵6～12 h 时，发酵液的NH3-N 浓度均处于适宜范围(6.3～27.5 mg·dL-1)[25]，而 发 酵24 h 时 体 外 发 酵 液 的NH3-N浓度并不在此浓度范围内，这可能是体外发酵缺少动物体内发酵所拥有的氮素循环机制导致了NH3-N的堆积[21]。泡叶藻、羊栖菜均可作为“益生元”调节肠道微生态，促进胃肠道微生物活性[26-27]。孙福昱[21]发现，海带(Laminaria japonica)、紫菜(Porphyra tenera)和裙带菜(Undaria pinnatifida)能够促进微生物的生长繁殖，并显著降低体外发酵液NH3-N 浓度，提高MCP 的生物合成量，说明藻类能够促进瘤胃氮代谢，提高动物生产性能。本研究中ASC3组和SAR3组发酵液NH3-N 浓度显著低于各自对照组，而MCP 浓度显著升高，这说明添加3%的泡叶藻和羊栖菜能够促进肠道微生物的活性，提高了NH3-N的吸收和转化。

3.3 ASC 和SAR 对体外发酵液乳酸浓度的影响

在高精料饲养水平下，瘤胃内淀粉分解菌会爆发性地增殖，产生大量VFA 导致瘤胃pH 下降。瘤胃pH 的迅速下降会使以牛链球菌为首的低pH 耐受菌大量繁殖，形成优势菌群，产生大量乳酸，在瘤胃内造成乳酸的堆积，引起瘤胃pH 进一步下降，并最终导致SARA 的发生[28]。研究发现，乳酸的解离常 数(pKa = 3.9)远 小 于VFA 的 解 离 常 数(pKa =4.8)，乳酸对瘤胃pH 的贡献率为TVFA 的近10 倍[20]。发酵24 h 时，泡叶藻和羊栖菜各添加组发酵液乳酸浓度均显著低于ASC0组，且ASC4组和SAR3组发酵液乳酸浓度最低，说明在瘤胃发酵过程中添加泡叶藻和羊栖菜有利于缓解乳酸的累积，添加量以4%和3%最为适宜。研究报道，海藻多酚是海藻的主要活性成分，能够抑制革兰氏阳性菌的产生[29]。泡叶藻是褐藻多酚含量最高的海藻之一[30]，瘤胃中乳酸产生菌大多为革兰氏阳性菌，泡叶藻中的海藻多酚可能抑制了乳酸产生菌的繁殖或者相较于乳酸利用菌而言其对产生菌的抑制作用更强。另外，羊栖菜多糖可以抑制α-葡萄糖苷酶的活性，降低瘤胃内碳水化合物的产生，从而降低牛链球菌产乳酸速率[31]，这在一定程度上可以阻止乳酸在瘤胃中快速堆积，减少瘤胃酸中毒的发生。

3.4 泡叶藻和羊栖菜对体外发酵液VFA 比例及浓度的影响

反刍动物碳水化合物的主要利用形式为VFA，其主要成分为乙酸、丙酸、丁酸，可占TVFA 总量的95%左右，同时VFA 也是反映瘤胃发酵、消化等代谢活动状况的重要指标之一[32]。已有研究发现[33]，奶山羊在亚急性瘤胃酸中毒时期表现出瘤胃液乙酸浓度降低，丙酸和丁酸浓度增加。Brossard 等[34]研究发现在发生亚急性瘤胃酸中毒后，绵羊瘤胃内乙酸浓度下降，丁酸浓度大幅升高。Penner 等[35]研究发现高精料饲喂的小母牛相比于正常组瘤胃液中乙酸的摩尔比例降低，丙酸和丁酸的比例显著升高。海藻内含有丰富的膳食纤维，在瘤胃发酵过程中可产生更多的乙酸[36]。另外，羊栖菜含有的岩藻多糖可以提高乙酸产生菌Alloprevoella的相对丰度[37]。本研究中，与对照组相比，添加泡叶藻和羊栖菜可有效提高发酵液乙酸比例和乙酸/丙酸，降低丙酸和丁酸比例。饲喂高精料日粮会引起反刍动物瘤胃中丁酸浓度迅速上升，破坏瘤胃上皮紧密连接，降低瘤胃上皮通透性，导致瘤胃上皮屏障功能受损，损害动物机体健康[38-39]。本研究中添加泡叶藻能够降低发酵液中丁酸比例，这与Zhou 等[26]试验结果一致。泡叶藻不仅能够通过抑制丁酸产生菌Roseburiasp.和Coprococcussp.来降低丁酸浓度，还可以提高瘤胃微生物对丁酸的代谢水平[26]。瘤胃中溶纤维丁酸弧菌的主要代谢物为乙酸和丁酸，并且能够将乙酸转化为丁酸。研究报道，多酚可降低体外发酵液中溶纤维丁酸弧菌的数量，从而降低丁酸比例[40]。本研究中，羊栖菜组发酵液丁酸比例降低，这可能是由于羊栖菜中多酚物质抑制了丁酸产生菌的生长繁殖。泡叶藻和羊栖菜中的生物活性物质均具有益生元效应，能够提高微生物的发酵效率[26,41]。发酵24 h 时，3%添加量的泡叶藻组和羊栖菜组TVFA 浓度均显著提高。本研究研究发现高精料饲粮中添加ASC 和SAR 可有效改善瘤胃发酵模式，提高体外发酵液乙酸比例和乙酸/丙酸。

4 结论

本研究发现添加泡叶藻和羊栖菜均能够有效缓解体外发酵液pH 降低，显著降低乳酸浓度，提高乙酸/丙酸，改善瘤胃发酵模式。在本研究条件下，两种海藻添加量为3%时对缓解瘤胃酸中毒具有积极意义。