循环肿瘤细胞与肝细胞癌分期、中医证型及预后的关系*

朱帅帅,邝玉慧,陈晓琦,赵强,袁长威,张传雷,王新亭,陈欣菊

1.河南中医药大学第一临床医学院,河南 郑州 450046; 2.天津中医药大学,天津 301617;3.河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000

根据美国肝病研究协会2018年实践指南,原发性肝癌是全球第五大常见肿瘤,也是癌症相关死亡的第三大原因[1-2],其中肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的肝癌类型,占肝硬化患者原发性肝脏恶性肿瘤的90%左右。我国肝癌患者约占到世界肝癌患者总数的55%,其死亡率在国内仅次于肺癌,排名第2[3-4]。肝癌死亡的原因多是由于肿瘤的复发和转移。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是从原发或继发性实体瘤中脱落进入血液循环系统的肿瘤细胞,被认为是肿瘤转移的“种子”,在癌症转移过程中起着重要作用,也是导致肿瘤复发的重要因素。CTC具有不同的表型,包括上皮型、上皮间质混合型(简称混合型)和间质型,不同类型的CTC转移能力不同[5]。上皮间质混合型CTC的侵袭转移能力更强,恶性程度更高[6]。分析CTC总数及不同表型与肝癌分期、中医证型及预后的关系,对临床预测预后、指导治疗均有非常重要的意义。随着现代生物医学实验技术的进步,CTC检测的灵敏性、特异性不断提高。CTC作为液体活检标记物判断原发性肝癌术后复发率报道较多[7-8],但其与临床分期、中医证型的关系及生存预后的研究较少。本研究运用CanPatrolTM系统在检测CTC数量的基础上,进一步对CTC进行分型检测,通过统计分析,探讨CTC及分型与肝癌患者的中医证型、肝癌分期及生存预后之间的关系,并进一步明确CTC在肝癌发展中的演变规律,为肝癌中医证型的标准化、客观化提供一定的参考依据,并为预测肝癌预后提供较精准的生物学指标。

1 资料与方法

1.1 病例纳入排除标准

1.1.1 纳入标准(1)符合HCC诊断标准;(2)均为初诊,未接受抗肿瘤治疗;(3)年龄18～75岁,性别不限;(4)自愿接受外周血 CTC检测;(5)患者或其法定代理人知情同意,并签署知情同意书。

1.1.2 排除标准(1)继发性肝癌患者;(2)语言交流障碍及无法完整叙述其病情的患者;(3)既往有精神病史或精神病倾向者;(4)合并肝性脑病患者;(5)妊娠期或哺乳期妇女。

1.1.3 剔除标准(1)不符合诊断标准、纳入标准而被误纳入者;(2)资料采集不完善者。

1.2 诊断标准西医诊断标准:符合《原发性肝癌诊疗规范》(2017年版)的诊断标准[9];中医辨证分型标准:参照《中医内科学》肝癌的中医证候标准进行诊断[10]。

1.3 研究设计先采用横断面研究,观察CTC总计数及分型与肝癌分期、中医证型的关系,然后每3个月随访1次,截至2022年12月,完成2年随访,分析CTC总计数与各期肝癌患者预后的关系。

1.4 观察指标主要指标:CTC计数及分型,次要指标:中医证型、肝癌分期、生存率、中位总生存期(median overall survival,mOS)、中位无进展生存期(median progression-free survival,mPFS)。

2 结果

2.1 75例患者临床资料情况及中医证型分布本研究共纳入75例原发性肝癌患者,基本信息详见表1。经正态性检验,CTC总计数及分型均不符合正态性分布,采用M(Q25,Q75)表示(表2)。在中医证型总体分布中以湿热聚毒证所占比例最高,共27例,占36%;其次是肝气郁结证26例,占34%;气滞血瘀证14例,占19%;肝阴亏虚证8例,占11%。中医证型在不同肝癌分期中的分布经统计分析发现,Ⅰb期肝癌患者以肝气郁结证为主,Ⅱ期肝癌患者以气滞血瘀证为主,Ⅲ期肝癌患者以湿热聚毒证为主,Ⅳ期肝癌患者以肝阴亏虚证为主。

表1 75例患者临床资料

表2 75例患者CTC及分型资料

2.2 CTC总计数、分型计数与肿瘤分期的关系经正态性检验,CTC、上皮型、混合型、间质型均不符合正态分布,采用秩和检验。分析所得不同肿瘤分期之间CTC总计数、上皮型CTC、混合型CTC、间质型CTC比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 CTC计数及分型计数与肿瘤分期的比较

经Spearman相关性分析所得,CTC总计数、上皮型CTC、混合型CTC、间质型CTC均与肿瘤分期呈正相关。其中CTC总计数与肿瘤分期(rs=0.700,P<0.05)呈强度正相关,上皮型CTC与肿瘤分期(rs=0.354,P<0.05)呈弱性正相关,混合型CTC与肿瘤分期(rs=0.677,P<0.05)呈强度正相关,间质型CTC与肿瘤分期(rs=0.392,P<0.05)呈弱性正相关(表4)。说明肝癌分期越晚CTC总数越高,同时存在着更高的恶性表型,提示预后越差。

表4 CTC总计数及分型计数与肿瘤分期的Spearman法分析结果

从表4可以看出,CTC总计数及混合型CTC与肝癌分期的相关性更强,提示CTC可以作为肝癌分期的客观标志物。为了进一步分析CTC总计数及其分型在肝癌分期中的诊断价值,笔者利用ROC诊断曲线进行相关统计学分析,一般认为AUC(ROC曲线下面积)>0.6、P<0.05时对分期具有判断价值(表5,图1)。

图1 不同肿瘤分期的CTC及其相关分型计数ROC曲线图

表5 CTC判断肿瘤分期模型AUC与P值

ROC诊断曲线分析提示,CTC总计数及分型计数对判断Ⅰ期肝癌患者,差异均无统计学意义(P>0.05),其对Ⅰ期肝癌患者的预测价值不大;CTC总计数判断肿瘤Ⅱ期的AUC面积最大为 0.865,之后由大到小为混合型CTC(AUC=0.850)、间质型 CTC(AUC=0.746)和上皮型CTC(AUC=0.685),差异均有统计学意义(P<0.05),对Ⅱ期肝癌患者有预测价值;混合型CTC在判断Ⅲ期肝癌的AUC面积最大为0.708,其次为CTC总计数(AUC=0.700),差异均有统计学意义(P<0.05),对Ⅲ期肝癌患者有预测价值。CTC总计数在判断Ⅳ期肝癌的AUC面积最大为0.954,其次为混合型CTC(AUC=0.917),差异均有统计学意义(P<0.05),两者AUC均>0.9,表明CTC和混合型CTC对Ⅳ期肝癌患者的预测价值均高。说明CTC总计数、混合型CTC和间质性CTC计数与肝癌分期呈正相关,特别是前两者在Ⅲ、Ⅳ期计数更高,提示当肝癌分期处于晚期时,CTC总计数及恶性表型更高,此时肿瘤的侵袭转移能力也更强。

2.3 CTC总计数及分型计数与不同中医证型的关系为了分析CTC总计数及分型计数与不同中医证型之间的联系,采用秩和检验分析,发现肝癌患者不同中医证型与CTC总计数、上皮型CTC、混合型CTC、间质型CTC比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表6。

表6 CTC总计数及分型计数与不同中医证型的比较 (mL-1)

从表6可以看出,湿热聚毒和肝阴亏虚两种证型CTC总计数和混合型CTC数量更多,湿热聚毒和肝阴亏虚两种证型为晚期肝癌常见证型,CTC相当于中医的“癌毒”,肝癌晚期癌毒肆虐,加重热、瘀、毒、痰湿,痰热互结耗伤阴津。因此,CTC为中医证候提供微观的物质基础。

进一步利用ROC诊断模型推断CTC总计数及其各分型计数对中医证型判断的价值。一般认为AUC(ROC曲线下面积)>0.6,P<0.05 认为该指标对于中医证型具有判断价值,见表7、图2。

图2 不同中医证型的CTC及其相关分型计数ROC曲线图

表7 CTC判断中医证型模型AUC与P值

通过分析ROC诊断曲线发现,CTC总计数、混合型CTC计数在判断湿热聚毒证和肝肾阴虚证时有更高的敏感度和特异度。其中CTC总计数在判断湿热聚毒证这一证型的诊断效能最高,此时ROC曲线下面积为0.799,最佳临界值为15.5,此时95%的置信区间为0.881～0.995,诊断效能最佳;混合型CTC在判断肝阴亏虚证的诊断效能最高,此时ROC曲线下面积为0.923,最佳临界值为20.5,此时95%的置信区间为0.844～1.000,诊断效能最佳。

由以上得出,CTC总计数及混合型CTC在预测肝癌中医证型方面更具有优势,提示CTC总计数及混合型CTC均可作为判断肝癌中晚期中医证型的客观指标。

2.4 CTC总计数对肝癌患者生存期的影响为了分析CTC总计数是否影响Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者的生存预后,我们对75例患者进行随访,其中失访3例,每3个月随访1次,末次随访时间为2022年12月。采用寿命表法进行生存分析,同时采用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型进行单因素分析,分析得出各期肝癌的CTC总计数阳性截断值均为15 mL-1(即当循环血中CTC总计数≥15 mL-1时,定义为阳性)。经分析:Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者2年病死率分别为43.59%(17/39)、80%(24/30),Ⅳ期肝癌半年病死率100%(3/3)。

进一步分析发现,Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者CTC总计数阴性患者的半年生存率为87.5%,1年、2年生存率分别为65.62%、59.37%,CTC总计数阳性患者的半年、1年、2年生存率均为28.57%(表8),二者之间差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者CTC总计数以PFS为随访终点时,其阳性患者mPFS为2个月,阴性患者mPFS为12个月;K-M曲线分析具有统计学意义(阳性截断值为15,P=0.001)(表9,图3);未进行中位总生存期(mOS)统计是因为阴性患者的死亡人数未达到 1/2;Cox 回归单因素分析显示,CTC总计数阳性是 Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者死亡的独立危险因素[HR:5.084,95%CI(1.667,15.506),P<0.05]。本研究对CTC总计数阳性是否为Ⅲ期肝癌患者死亡的独立危险因素进行分析,差异无统计学意义(P>0.05),可能的原因在于晚期肝癌患者由于癌栓、远处转移等因素影响患者预后。

图3 Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者CTC总计数PFS生存曲线

表8 Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者生存率表

表9 Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者CTC总计数无进展生存期生存分析表

Ⅲ期肝癌患者CTC总计数以无进展生存期(progressively free survival,PFS)为随访终点时,其阳性患者mPFS为5个月,阴性患者mPFS为10个月;K-M曲线分析具有统计学意义(阳性截断值为15,P=0.003)(表10,图4);Ⅲ期肝癌患者CTC总计数以(overall survival,OS)为随访终点时,其阳性患者mOS为8个月,阴性患者mOS为15个月;K-M曲线分析具有统计学意义(阳性截断值为15,P=0.034)(表11,图5)。

表10 Ⅲ期肝癌患者CTC总计数PFS生存分析

表11 Ⅲ期肝癌患者CTC总计数OS生存分析表

由以上数据可以证明,当患者体内CTC总计数低于阳性截断值时,Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者的生存率明显提高,mPFS、mOS明显延长。因此,CTC总计数可以成为Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期HCC患者生存预后客观预测指标。

3 讨论

3.1 中医证型与临床分期的关系分析肝癌患者由于疾病的发展,中医证型也处于动态演变中。周蓓等[11]在总结周岱翰教授对肝癌的临床辨证论治中结合现代医学研究将肝癌分为早初期、中期、晚期。周岱翰[12]认为,肝癌病机以瘀、热、虚为主要特点,早期以肝热血瘀证为主,中期以肝盛脾虚证为主,晚期以肝肾阴虚证为主,说明中医证型与肝癌的分期具有一定的关系。因此,研究证型动态变化规律、有的放矢,对临床工作具有很重要的指导意义。

本研究发现,原发性肝癌患者不同临床分期中医证型分布不同,Ⅰ期主要为肝气郁结证、Ⅱ期主要为气滞血瘀证、Ⅲ主要为湿热聚毒证、Ⅳ期主要为肝阴亏虚证。肝癌早期主要由于邪气盛而正气未衰,肝失疏泄、脾失健运主要以肝气郁结为主,随着疾病的进展瘀邪、湿邪逐渐增多,癌毒结聚,以气滞血瘀、湿热聚毒为主,后期由于正气不断耗伤,癌毒攻伐机体,出现邪盛正衰的局面,则以肝肾阴虚为主[13]。

3.2 CTC与不同中医证型的关系分析本研究通过Wilcoxon秩和检验发现,CTC及分型在中医证型间存在统计学差异(P<0.05),CTC和混合型CTC在肝阴亏虚证和湿热聚毒证中较高。以上研究说明,CTC总数与其侵袭性分型(间质型 CTC和混合型 CTC)与肝癌的进展有关,湿热聚毒证和肝阴亏虚证是中晚期肝癌的常见证型[14-15]。肿瘤组织及其代谢产物在中医上称为癌毒,与CTC内涵相同。中期肝癌癌毒炽盛,邪盛正衰,湿热瘀毒互结,晚期肝癌癌瘤盘根错节,胃气衰败,肝血亏虚,耗伤正气,下劫肝阴,导致肝肾阴虚。因此,CTC表达与中晚期肝癌核心病机“正虚、湿热、瘀毒”存在必然的关联性。陈克秀[16]研究发现,不同中医证型CTC表达水平存在差异,其中热毒郁结型患者CTC表达量最高。华建辉[17]发现,血瘀证和非血瘀证的乳腺癌患者外周血中CTC表达量比较,差异具有统计学意义(P<0.05),说明CTC表达量与中医证型具有相关性。

3.3 CTC与肝癌分期的关系分析临床肝癌分期主要依赖增强CT或MRI等影像学检查,影像学检查对与肝癌早期的血行转移不敏感,容易造成肝癌分期的误判和治疗方案选择上的失误。CTC检测可比影像学早2～6周发现肿瘤复发转移倾向。研究已证实,CTC与肿瘤分期存在相关性。Sastre等[18]利用CellSearch系统对大肠癌患者的研究发现,CTC检出率随着分期级别的增高而升高。Xu等[19]对85例肝癌患者统计CTC阳性率,发现肝癌中CTC阳性率与TNM分期存在相关性。Krebs等[20]在对非小细胞肺癌患者的研究中发现,Ⅲa和Ⅲb期患者的CTC数目明显低于Ⅳ期患者。Schulze等[21]尝试利用CTC数目对肿瘤进行临床分期,结果显示与病理分期的一致率为61%。刘春花等[22]通过CTC计数的方法对65例肺癌患者进行研究,发现CTC数目随着分期级别增加而增多,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的阳性率分别为23.08%、50.00%、90.00%。以上研究表明,CTC检测法可作为肿瘤分期的检测方法之一。CTC检测方法与影像学或病理学方法相结合,可更加精确地反映患者肿瘤分期,这些都说明CTC与肿瘤分期具有一定的相关性。

本研究发现,CTC总计数、混合型CTC 均与肿瘤分期呈正相关,这说明外周血中的CTC、混合型CTC可能是判断肝癌疾病进程的潜在标志物[23-25]。黄祥奇等[26]通过采用Spearman相关分析发现,CTC总数与肿瘤的临床分期呈正相关,其CTC的分型上皮型CTC、混合型CTC的数量均与临床分期呈正相关,但未发现间质型CTC与临床分期相关。本研究与既往临床研究基本一致,可认为CTC是判断肿瘤分期的潜在指标。这一研究结果表明,随着肝癌患者病情的加重,其肝癌分期越高,血液当中CTC的表达水平也越高,其恶性表型的含量越高。故临床可以通过检测CTC早预判患者具体分期,进而选择对患者更有益的治疗方式。

3.4 CTC总计数可以作为肝癌患者生存预后的指标CTC是肿瘤转移的“种子”。研究表明,CTC及其分型与肿瘤的预后密切相关[27]。本研究对72例肝癌患者进行了2年随访,通过生存分析发现,Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者2年病死率分别为43.59%(17/39)、80%(24/30)、Ⅳ期肝癌半年死亡率100%(3/3),Ⅰb～Ⅱ期肝癌患者CTC总计数阴性患者的半年、1年、2年生存率也高于阳性患者;Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者以PFS、OS为随访终点时,其CTC总计数阳性患者的生存时间均明显低于阴性患者。以上说明,当CTC总计数达到一定数量时,肿瘤的转移和复发快速进展,患者的mOS、mPFS也更短;COX回归单因素分析显示,CTC总计数是Ⅰb～Ⅱ期HCC患者无进展生存期的独立危险因素。由以上可以得出,高CTC总计数不利于患者的长期预后,提示HCC患者进入疾病快速进展期,可作为HCC患者生存预后的预测指标。

4 结语

本研究发现,CTC总计数及其分型与HCC的中医辨证分型存在内在联系,可以作为原发性肝癌中医辨证分型的客观参考指标;CTC总计数及其分型与HCC分期具有相关性,分期越晚CTC总计数及混合计数越高,提示其对肝癌疾病严重程度及预后有预警意义;当CTC总计数阳性截断值>15 mL-1时,Ⅰb～Ⅱ期、Ⅲ期肝癌患者的生存率、mOS、mPFS相对于阴性明显降低。