Box-Behnken响应面法优化地黄酵素的制备工艺及质量评价*

何江龙,牟文荣,张童童,纪宝玉,3,裴莉昕

1.河南中医药大学药学院,河南 郑州 450046; 2.河南省道地药材生态种植工程技术研究中心,河南 郑州 450046;3.天津大学药物科学与技术学院,天津 300072

地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根,具有清热凉血、滋阴生津等功效,其化学成分主要含有环烯醚萜类、三萜类、木脂素类、黄酮类、酚酸类等[1]。地黄道地产区为河南焦作(古怀庆府),是著名的“四大怀药”之一,也是六味地黄丸等诸多中成药的要药。地黄的炮制品被收录于药品及保健品目录中,地黄相关的保健品、功能食品等较多,但地黄酵素等生物发酵制品的研究少见,以地黄为原材料,通过酵母菌和乳酸菌的双重发酵制作酵素不但能够解决新鲜地黄不易贮存的问题,还能缩短发酵时间提升口感[2-3],同时作为一种新型饮片的新兴态势,具有一定的研究意义和实用价值。

传统酵素中含有丰富的多糖、酚酸、氨基酸、蛋白质等活性成分,在医疗保健中应用广泛[4-5]。吕明珊等[6]、李相禹等[7]以总酚酸为指标,以桑葚、猕猴桃为原料进行响应面分析得到桑葚和猕猴桃的最佳发酵工艺条件。地黄中所含的酚酸是一类含有酚环的有机酸,是广泛存在于自然界生物体内的天然功能性高分子化合物[8],具有极强的自由基清除能力和抗氧化功能[9-10],可延缓机体衰老、预防心血管疾病,具有抗炎、抗肿瘤、抗溃疡等功效[11-12]。

本文以四大怀药中的地黄为原料,在单因素实验基础上,通过研究地黄酵素发酵过程中多酚含量的变化,对影响制备地黄酵素工艺的各因素进行Box-Behnken实验设计和响应面优化,以期获得地黄酵素发酵的最佳工艺,为新型中药制剂地黄酵素的开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂实验材料采集于河南省焦作市沁阳陈庄村,经河南中医药大学董诚明教授鉴定为玄参科植物地黄的新鲜块根;酵母菌:安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳杆菌:北京北纳创联生物技术研究院;MRS琼脂、MRS肉汤、YPD液体培养基、蔗糖:北京索莱宝科技有限公司。没食子酸标准品、葡萄糖标准品:上海源叶生物科技有限公司;福林酚、茚三酮、Na2CO3、NaNO2、Al(NO3)3:麦克林生物科技有限公司;乙腈、甲醇、磷酸:赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备洁净工作台SW-CJ-1FD(苏州安泰空气技术有限公司);高压蒸汽灭菌锅 KG-AP40M(KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC);电子分析天平 FA2004N-01156(上海民桥精密科学仪器有限公司);高速冷冻离心机JW-3021HR(安徽嘉文仪器装备有限公司);精密台式pH计FE28(海梅特勒-托利多仪器有限公司);多功能微孔板读数仪VLBL0TD0(河南德信汇仪器设备有限公司)、高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)。

1.3 测量方法

1.3.1 地黄酵素中总酚酸的含量测定采用Folin-Ciocalteu法测定地黄酵素多酚的含量[13-14],绘制没食子酸标准曲线。没食子酸的浓度C (mg·L-1)与吸光值A的标准线性方程是y=0.005 6x+0.063 6,R2=0.999 0。结果表明没食子酸标准溶液吸光度与其浓度在0～100 mg·L-1存在较好的线性关系。取0.10 mL地黄酵素液至1.5 mL试管中,加入10%的福林酚溶液0.50 mL,6 min后加入0.40 mL的7.5%Na2CO3,避光保存40 min后,于765 nm波长处测试样吸光值,每只试样重复3次,统计平均值,并根据回归曲线计算发酵液中的总酚酸含量。

1.3.2 地黄酵素pH值的测定参照GB-10468-1989方法对地黄酵素样品上清液进行检测,每个样品重复3次,计算平均值。检测前,在25 ℃下将酸度计用pH 4.00、6.86、9.18的标准缓冲液进行校准。

1.3.3 地黄酵素中梓醇、地黄苷D的含量测定参考李洵等[15]采用HPLC多成分同时测定的方案,略做修缮,对地黄酵素中的梓醇及地黄苷D进行含量测定,并绘制标准曲线。梓醇的浓度C(mg·L-1)和吸光值A的标准线性方程为y=11 949x+1523.9,R2=0.999 5,结果表明,梓醇标准溶液的吸光度在75～2 400 mg·L-1范围内与浓度呈良好的线性关系;地黄苷D的浓度C(mg·L-1)和吸光值A的标准线性方程为y=9 901.7x-0.286 7,R2=0.999 9,结果表明,梓醇标准溶液的吸光度在7.5～300.0 mg·L-1范围内与浓度呈良好的线性关系。取地黄酵素液临用前用0.22 μm微孔滤膜过滤,测量样品的吸光值,每个样品重复3次,计算平均值,并根据回归曲线计算发酵液中的相对物质含量。

1.3.4 地黄酵素中还原糖的含量测定采用DNS法对地黄酵素还原糖的含量进行测定[16-17],并绘制葡萄糖标准曲线。葡萄糖的浓度C (mg·L-1)与吸光值A的标准线性方程是y=1.028 6x-0.005 2,R2=0.9992。结果表明葡萄糖标准溶液吸光度与80～720 mg·L-1之间存在较好的线性关系。取地黄酵素液0.10 mL,加入DNS试剂0.20 mL 混匀,沸水水浴5 min,显色后冷却至室温,加蒸馏水至 4 mL,于540 nm波长处测试样品吸光度,每只样品重复3次,取平均值,并根据回归方程计算发酵液中的还原糖含量。

1.4 实验方法

1.4.1 地黄酵素工艺流程新鲜地黄→切片烘干→打粉过筛→加水→超声→灭菌→(菌种→活化→扩大培养)接菌发酵→终止发酵→贮藏。

1.4.2 操作要点(1) 菌种活化及培养。在YPD液体培养基和MRS液体培养基分别接种上酵母菌和乳酸菌,封口后在摇床内28 ℃、160 r·min-1条件下培养酵母菌,在37 ℃,100 r·min-1条件下培养乳酸菌,使菌株到达对数生长期。(2) 地黄酵素的制备。选取地黄供试材料,洗净切片,烘干粉碎,过三号筛,加入适量蔗糖,调整糖度,加入40 mL水,超声30 min后,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,以1：3的比例接种活化好的酵母菌、乳酸菌液,130 r·min-1、37 ℃条件下恒温培养48 h,制备地黄发酵液。

1.4.3 单因素实验以料液比(1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50)、发酵时间(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h、108 h)、初糖量(0.0 g、0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g、0.6 g)、发酵温度(28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、43 ℃)、酵母菌同乳酸菌接菌比例(2：1、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)为单因素进行实验。见表1。

1.4.4 Box-Behnken响应面分析采用Design-Expert 11软件展开响应面实验设计。以-1,0,1代表自变量水平,以地黄发酵总酚酸含量为响应面值进行优化处理,进行方差分析。

2 结果

2.1 单因素实验

2.1.1 初糖量对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响在发酵过程中,蔗糖为微生物生长提供碳源,地黄粉含有氨基酸和蛋白质为微生物生长提供氮源。在氮源和碳源适宜的条件下,微生物生长繁殖速度会大大提高,从而使代谢产物增加[18]。随着初糖量的增加,pH值呈现先减小后增加趋势,总酚酸含量呈现先增加后减小趋势。此现象可能由于氮源不足从而导致微生物代谢发生了改变。在初糖量为0.4 g时,pH值达到最低点5.11,总酚酸含量达到最高点53.09 mg·L-1,因此认为最佳初糖量在 0.4 g 左右。见图1。

图1 初糖量对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响

2.1.2 接菌比例对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响酵母菌与乳酸菌作为传统发酵剂,在发酵过程中主要有共生与拮抗两种关系,直接影响着发酵液的质量。通过调整接菌比例,一方面使发酵原料充分利用,另一方面获得更理想的发酵产物[19]。随着接菌比例增加,pH值呈现先增加后减小再增加趋势,总酚酸含量呈现先增加后减小趋势。此现象可能由于在不同发酵阶段,由于酵母菌与乳酸菌拮抗和共生关系不同,从而导致代谢产物产生差异。在接菌比例为1：3时,pH达到最低值4.72,总酚酸含量达到最高值为64.29 mg·L-1,因此认为最佳接菌比例在1：3(酵母菌：乳酸菌=1：3)左右。见图2。

图2 接菌比例对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响

2.1.3 发酵时间对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响当发酵时间较短,原料没有被充分利用。当发酵时间过长,微生物逐渐衰亡,导致杂菌生长,从而影响最终代谢产物[20]。随着时间增加,pH值呈现先降低再升高后降低的趋势,总酚酸含量呈现先升高再降低的趋势。此现象可能是由于发酵时间过长,导致微生物逐渐死亡,杂菌生长。当发酵时间在96 h时,pH达到最低值4.05,总酚酸含量达到最高值110.23 mg·L-1,因此认为最佳发酵时间应该在96 h左右。见图3。

图3 发酵时间对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响

2.1.4 发酵温度对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响发酵过程中,随着温度不断增加,pH值呈现先降低然后逐渐升高趋势,总酚酸含量呈现先升高后降低趋势。此现象可能由于较低的发酵温度可以抑制地黄酵素液中酶的活性从而减缓代谢的速度,过高的温度也会影响酶的活性与微生物生长,甚至使酶失活[21],从而导致代谢产物减少甚至丧失。当发酵温度在37 ℃时,pH达到最低值4.16,总酚酸含量达到最高值75.22 mg·L-1,因此认为最佳发酵温度应该在37 ℃。见图4。

图4 发酵温度对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响

2.1.5 料液比对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响地黄发酵随着料液比的增加,其总酚酸含量逐渐降低,其发酵后的pH值呈现先下降后升高的趋势,当料液比为1：40时其pH值最低为4.64,原因可能是料液比过低时,地黄溶液浓度过高,不利于乳酸菌和酵母菌的发酵,从而使地黄酵素中pH值下降较慢,料液比过高时,地黄溶液浓度过低,使得酵素中的酚酸含量被稀释[22],从而使pH值升高。因此料液比选在1：40左右较为合适。见图5。

图5 料液比对地黄酵素pH值和总酚酸含量的影响

2.2 Box-Behnken响应面实验结果与分析

表2 Box-Behnken响应面实验设计与结果

2.2.2 模型方差分析利用Design-Expert 11软件建立总酚酸含量的多元二次回归响应面模型,通过多元线性回归和二项拟合对实验结果进行分析,验证回归模型与因素的显著性。建立的回归模型中F值为13.88,P值<0.000 1,表明本实验建立的回归模型的差异极显著;失拟项P值为0.010 7<0.05,同样可以说明模型差异显著。一次项中初糖量(A)和发酵温度(D)对总酚酸含量的影响较显著,接菌比例(B)与发酵时间(C)的影响不显著;二次项中A2、B2和C2对总酚酸的影响均不显著,D2对总酚酸含量的影响极显著;交互项中AB、AC、BC、AD、CD、BD对总酚酸含量的影响均不显著。将表3中F值的大小进行比较可得出结论:4个因素对总酚酸含量的影响程度大小为发酵温度(D)>初糖量(A)>接菌比例(B)>发酵时间(C)。见表3。

表3 方差分析

2.2.3 各因素交互作用的响应面与等高线结果分析响应面图可以直观地反映出两变量对因变量的影响程度,曲面坡度愈陡,实验时因变量对响应值的影响程度愈大,而当曲面坡度较小时,则说明实验中因变量对响应值的影响很小;等高线图越趋向椭圆,表明两变量之间的交互作用越显著,等高线图越趋向圆形,则代表两变量之间的交互作用越小[23]。根据响应面回归模型所建立的初糖量(A)、接菌比例(B)、发酵时间(C)、发酵温度(D)的交互效应响应面图及等高线图见图6。

图6 交互效应响应面图及等高线图

在固定因素发酵时间(C)与发酵温度(D)的情况下,随着初糖量(A)的增加,总酚酸含量呈现递增趋势;随着接菌比例(B)增加,总酚酸含量呈现先增加后减小趋势。在初糖量为0.45～0.50 g,接菌比例为2.0～2.5时,总酚酸含量在较高范围内。固定接菌比例(B)与发酵温度(D),随着发酵时间(C)不断增加,总酚酸含量呈现出先增加后减少的趋势;随着初糖量(A)增加,总酚酸含量呈现增加趋势。在发酵时间为84～90 h,初糖量为0.45～0.50 g时,总酚酸含量处于较高水平。在固定接菌比例(B)与发酵时间(C)的情况下,随着发酵温度(D)的增加,总酚酸含量呈现先增加后减少的趋势;随着初糖量(A)增加,总酚酸含量呈现增加趋势。发酵温度为34～36 ℃,初糖量为0.45～0.50 g时,总酚酸含量较高。固定初糖量(A)与发酵温度(D),随着发酵时间(C)与接菌比例(B)不断增加,总酚酸含量呈现先增加后减小的趋势。发酵时间为84～90 h,接菌比例为2.0～2.5时,总酚酸含量在较高范围。在固定初糖量(A)与发酵时间(C)的情况下,随着接菌比例(B)和发酵温度(D)的增加,总酚酸含量呈现先增加后减少趋势。在接菌比例为2.0～2.5,发酵温度为34～36 ℃时,总酚酸处于较高水平。在固定接菌比例(B)和初糖量(A)的情况下,随着发酵时间(C)和发酵温度(D)的增加,总酚酸含量呈现先增加后减少趋势。当发酵温度为34～36 ℃,发酵时间为84～90 h时,总酚酸含量处于较高水平。

2.2.4 验证性实验结果与分析对回归拟合方程进行求解,得出总酚酸含量最高时最佳条件:A=0.499 0 g,B=2.284：1,C=85.97 h,D=35.107 ℃此条件下,预测最佳总酚酸含量为81.677 mg·L-1。根据实验和实际操作可行性,调整后的地黄酵素制备工艺条件为:初糖量为0.499 0 g,接菌比例为 2.280：1(即乳酸菌比酵母菌为456 μL：200 μL),发酵温度为35.1 ℃,发酵时间为86 h。采用优化后的工艺制备地黄酵素进行验证性实验,得到验证性实验结果为:总酚酸含量为83.165 mg·L-1,预期总酚酸含量为81.766 mg·L-1,同模型预测相对误差仅为1.71%,说明响应面法对地黄酵素制备工艺优化的参数较为准确可靠,具有一定应用的价值性。

2.3 地黄酵素的品质分析

2.3.1 地黄酵素中梓醇、地黄苷D的含量通过酵母菌和乳酸菌对地黄进行发酵制得的地黄酵素,其梓醇含量为2.170%,地黄苷D含量为0.466%;参照2020版《中华人民共和国药典》地黄中梓醇含量不少于0.20%,地黄苷D含量不少于0.10%的规定,此方法制得的地黄酵素符合要求。何伟等[24]、罗盟錡等[25]、刘秋瑾等[26]对灵芝、甘草、黄芪、板蓝根进行发酵研究,均有新的发现,可为下一步地黄新型饮片的开发提供较好的参考和实际的数据支撑。同时,目前利用微生物发酵中药是中药研发的新途径,在此基础上,还可拓展其在食品、保健品行业等更多领域的应用范围,具备很好的开发价值。

2.3.2 地黄酵素总酚酸含量对地黄液和地黄酵素进行总酚酸含量测定结果显示,地黄液总酚酸含量为62.904 mg·L-1,发酵后地黄酵素总酚酸含量为83.165 mg·L-1,相对发酵前总酚酸含量提升了32.2%,这同易媛等[27]、周偏等[28]和高振鹏等[29]对桑葚酵素、诺丽酵素和苹果酵素中酚酸含量测定的结果一致,发酵后总酚酸含量增加,分析原因可能是微生物可以将共价键结合的酚酸物质降解为小分子酚酸物质,也可能是微生物使地黄中的生物活性物质进行代谢,产生了新的酚类化合物,导致总酚酸含量升高。总酚酸具有抗氧化、防腐等作用,常作为抗氧化剂、杀菌剂应用于果蔬保鲜,其含量的增高可使地黄酵素更易贮藏。

2.3.3 地黄酵素还原糖含量对地黄液和地黄酵素进行还原糖含量测定结果显示,地黄液还原糖含量为376.76 mg·L-1,地黄酵素液还原糖含量为614.25 mg·L-1,比发酵前提高了63.03%;地黄经发酵后还原糖含量增加。在此之前,易媛等[27]、刘磊等[30]和谢东东等[31]对桑葚、米糠以及不同水果进行发酵,研究发现还原糖含量呈不断下降的趋势;在胡萝卜汁发酵的研究中发现多糖含量增加,还原糖含量降低,这同地黄发酵的结果相反,原因可能是发酵过程中糖类物质被微生物不断降解利用,导致还原糖含量不断下降;也可能其在发酵过程中合成果糖基转移酶,使单糖主要转化为多糖,导致还原糖含量降低[32-33]。本实验地黄经发酵后还原糖含量增加,分析原因可能是不同微生物对多糖的降解效果存在显著差异[34],也可能是由于地黄中的多糖含量较多,酵母菌和乳酸菌对地黄多糖进行降解,其代谢产生的各种消化酶能将多糖分解为小分子还原糖[31],最终导致还原糖含量增加。地黄还原糖具有补气血的作用,且在地黄炮制后含量变化最为显著,其含量的增高说明对地黄进行发酵处理制作酵素新型饮片具备可行性。

3 结论

笔者以“四大怀药”中的地黄为原料,用酵母菌和乳酸菌进行发酵制备地黄酵素。在单因素实验的基础上进行了4因素3水平的响应面实验,得出各因素对地黄酵素总酚酸含量的影响从高到低为发酵温度>初糖量>接菌比例>发酵时间。考虑实验的实际性和可操作性,将地黄酵素最优工艺参数调整为液料比40 mL：1 g、初糖量0.499 0 g、乳酸菌和酵母菌接菌比例为2.280：1、发酵时间为86 h、发酵温度为35.1 ℃。在此条件下地黄经发酵后,pH值由6.19降至4.33,总酚酸含量由62.904 mg·L-1升至83.165 mg·L-1,相对发酵前总酚酸含量提升了32.2%;还原糖含量由376.76 mg·L-1升至 614.25 mg·L-1,相对于发酵前还原糖含量提高了63.03%;且梓醇、地黄苷D含量均符合2020版《中华人民共和国药典》的要求。地黄酵素含有较高的酚酸类物质和还原糖,作为一种酵素饮品可以很好地满足人们对营养的需求;含有的梓醇、地黄苷D含量符合药用地黄标准,作为一种新型中药制剂可以很好地满足临床用药的需求。本实验结果可为规模化制备地黄酵素提供一定的参考,更优化的制备工艺及总酚酸的理化性质均有待进一步的深入研究。