有机肥改变了退化人工草地微生物群落网络结构和潜在功能

周学丽, 史德军, 刘汉江, 丁建昭, 马 军, 张海娟, 颜珲璘, 王英成, 金 鑫, 祁鹤兴, 芦光新*

(1.青海大学农牧学院, 青海 西宁 810016; 2.青海省草原改良试验站, 青海 共和 813099)

饲草是青海省草食畜牧业发展与牧民生计提升的特色产业,是生态文明建设、打造青海成为全国绿色有机农畜产品输出地和实现全省高原特色绿色高质量发展的核心和重要物质基础。面临生态环境保护和社会经济可持续发展的双重压力,建植人工草地是解决草地资源缩减和草食畜牧业发展受限等问题的最佳手段[1-2]。《“十四五”全国饲草产业发展规划》也明确指出“青藏高原地区统筹推进人工种草和天然草原利用,建设高标准人工饲草料地,打造专业化饲草生产加工基地,保障区域内优质饲草均衡供应”。由此可见,加强饲草种植模式、促进饲草提质增效对于解决高寒地区草畜不平衡的矛盾、保护草地资源和促进草牧业持续发展具有重要意义。然而,建植的人工草地因草种单一、群落结构稳定性较差,无法维持生产和生态功能的可持续性[3]。施肥是草地改良和恢复的有效的措施之一,鉴于青海省高寒草地生态保护价值,探索施用有机肥对退化草地改良以及保护好青海这片净土的生态环境、实现农牧业持续健康发展具有十分重要的意义[4]。肥料对农业生产发展,特别是粮食生产的发展具有重要作用。但近年由于化肥使用过量,肥料施用不合理,导致部分环境受到污染农业生产生态条件恶化,肥料使用效果下降[5]。有机肥为土壤微生物的活动提供所需的碳源、氮源和能量,并改善土壤微生态环境的理化性状,促进微生物的生长和繁殖,增加微生物数量和活性,优化土壤微生物群落的结构和功能[6-7]。朱瑞芬等[8]研究认为施氮可以调控微生物群落网络的关键物种,进而改变其分子生态网络结构。该课题组前期的研究表明,施有机肥能够促进高寒地区牧草生物量的增加[9],同时,施有机肥能够改善土壤根际微生物群落结构,进一步改善土壤健康状况,是一项高寒地区草地恢复的有效措施[10-11]。因此,本文尝试通过施有机肥改良人工退化草地,从微生物互作网络的角度探索微生物对施有机肥的响应,以期获得外源有机肥添加条件下土壤微生物动态变化的关键节点和规律,为退化人工草地的恢复提供科学依据,对于推动草食畜牧业提档升级以及保障国家粮食安全具有重要意义。

植物和土壤生物的互作是农学和生态学的一个研究热点,植物-土壤-微生物反馈理论的提出和发展,加深了对微生物调节物种多样性-生产力关系等作用的理解,在高寒地区牧草种植研究中发现,细菌群落网络结构的稳定性和复杂性与禾/豆混播牧草生物量的增加是一致的[12]。基于上述相关理论,本文以环青海湖地区的退化人工草地为研究对象,探究施有机肥对植被、土壤理化性质及土壤微生物群落的影响。采用高通量测序技术和分子网络分析技术,分析草地土壤微生物的多样性、群落组成和与环境因子之间的相关性,旨在从土壤微生物角度,评价施用有机肥后土壤微生物群落结构、分子生态网络结构以及潜在的功能变化,探索微生物对推进高产优质、绿色高效现代农业中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于青海省草原改良试验站的人工草地,海拔3 270 m,经纬度为37°03′ N,99°33′ E,年平均气温-0.7℃,绝对无霜期为20 d。年平均降水量为368.11 mm,相对湿度58%,年蒸发量1 495.3 mm,土壤为暗栗钙土。该人工草地于2016年5月份建植,播种草种为‘青海’冷地早熟禾(Poapratensis‘Qinghai’),每年秋季收获种子,冬季适度放牧,2019年实施草场封育,无采取任何田间管理措施,开始出现优势牧草减少、植被覆盖度降低和毒杂草增多等草地退化现象,主要伴生物种有:车前(Plantagoasiatica)、鹅绒委陵菜(Potentillaanserina)、黄芪(Astragalusmembranaceus)、猪毛蒿(Artemisiascoparia)和密花香薷(Elsholtziadensa)等物种。为改良草场并提高草地资源利用率,于2020年6月中旬免耕补播的同时进行施有机肥试验。

1.2 试验设计

在试验区选择牧草生长状况基本一致的样区(50 m×50 m),分别设置施有机肥与不施肥2个处理,每个处理为3 m×5 m小区,随机排列,重复5次。每个小区间均设1.5 m的缓冲带,缓冲带上不做任何处理。施肥量为800 kg·hm-2(有机质含量≥45%,N+P2O5+K2O≥5%),撒施。试验设计如图1所示:

图1 试验设计图

1.3 研究方法

1.3.1植被群落结构调查 2020年8月中旬,采用样方法进行植被群落调查,在所设定的10个小区内进行植物种类、物种数、群落总盖度和物种自然高度测定,群落总盖度的测定采用针刺法;生物量测定采用刈割法:齐地面剪取植被的地上部分,装于信封袋中并称取鲜质量。

1.3.2土壤样品的采集与处理 在取过地上生物量的样方内将土壤表层的残留物和杂质清理干净,然后用7.5 cm直径土钻按S型在一个样方内随机取0-20 cm钻取5钻混合后装入带有样品编号的自封袋中(每个样方做两遍),带回实验室,过40目土筛并剔除所有杂质。将采集的土壤样品分成两部分,一部分保存于4℃用于土壤理化参数测定,其余部分保存在-80℃冰箱准备提取DNA。

1.3.3土壤理化性质测定 测定的土壤指标有:土壤全氮、有机质、硝态氮、铵态氮,各指标均采用常用化学分析法进行测定[13]。土壤全氮含量使用凯氏定氮法,有机质含量使用重铬酸钾-油浴加热法,铵态氮含量采用靛酚蓝比色法,硝态氮含量采用紫外分光光度法[14],土壤水分(Soil moisture,SM)、土壤电导率用便携式土壤三参数仪测定(型号TDR-350,Spectrum,德国)在样品采集时直接测定,重复3次,记录数据。

1.3.4土壤微生物DNA提取、PCR扩增和测序 采用土壤DNA提取试剂盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美国)提取土壤微生物总DNA。采用NanoDrop-ND1000 测定DNA浓度,并经2%琼脂糖凝胶电泳对DNA样品质量进行检测,合格后用于构建文库;以土壤样品微生物总DNA为模板,分别用16SrDNA V4区(515F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′;806R:5′-GGACTACHVG-GGTWTCTAAT-3′);ITS2区5.8F,5′-AACTTTYRRCAAYGGATCWCT-3′ 和4R,5′-AGCCTCCGCTTATTGATATGCTTAART-3′[15]且带有10 bp长的barcode序列的特异引物为扩增引物进行PCR扩增,采用KAPA HyperPrep Kit DNA文库构建测序文库,在Illumina Miseq平台进行测序(深圳,美格基因)。

1.4 数据处理及分析

1.4.1植被数据处理及分析 采用SPSS26.0软件做T检验,以确定植被、土壤和微生物相关因子在两组间的统计学差异(P<0.05),利用Excel软件整理数据并用Origin 21.0作图。

1.4.2微生物数据处理及分析 将所有原始数据以FASTQ格式以及样本对应的Barcode信息上传到中科院生态环境研究中心邓晔老师课题组的Galaxy分析平台上(http://mem.rcees.ac.cn:8080)进行分析。测序数据采用Btrim和FLASH进行过滤优化和双端序列连接,优质序列利用UPARSE[16]基于97%的相似水平进行OTU(Operational taxonomic units)聚类,并且通过RDP分类数据库对OTU表进行注释。基于OTU丰度信息,利用R语言工具制作Venn图和群落柱形图,利用Mothur软件[17]计算微生物群落结构多样性用物种丰富度(Richness)、Shannon-Wiener多样性指数、以及Pielou均匀度指数表示,采用PCA法对不同施肥处理和对照中土壤微生物群落的差异进行研究分析;通过ANOSIM,MRPP以及PERMANOVA三种方法进行不相似性检验(Dissimilarity test),基于FAROTAX[18]对细菌群落功能进行预测,基于FUNGuild对真菌群落功能进行预测。

1.4.3分析生态网络构建 为了阐明施肥对土壤中微生物相互作用,我们通过随机矩阵构建了系统发育的(Molecular ecological networks)MENs。基于理论(RMT)的单边网络分析方法(MENA,http://ieg2.ou.edu/MENA),得到4个网络。对于细菌和真菌,少于4个样本中出现的OTU不会进入到网络中。通过设置合适的阈值(未删除低丰度的和未知的OTU),构建分子生态网络MENs[19]。对单边网络的拓扑结构(节点(node)、边(edge)、平均度(avgK)、平均聚类系数(avgCC))进行了分析。单边网络图使用Gephi进行可视化。对网络的核心物种进行分析,依据节点的拓扑特征可将节点属性分为4种类型,包括:Module hubs (模块中心点Zi >2.5且Pi<0.62),Connectors (连接节点,Zi<2.5且Pi >0.62),Network hubs (网路中心点,Zi >2.5且Pi >0.62)以及Peripherals (外围节点,Zi<2.5且Pi <0.62)。

2 结果与分析

2.1 植被群落结构功能

如表1所示,施有机肥处理后,植被盖度与对照相比差异极显著(P<0.01),而高度、地上生物量及物种数与对照相比均有升高,但差异不显著。

表1 植被群落结构功能

2.2 土壤理化性质分析

由表2可以看出,施有机肥处理后,土壤全氮、铵态氮、硝态氮、有机质分别提高 17.28%,5.24%,0.97%,28.69%,但差异不显著。土壤湿度含量则显著高于对照(P<0.05),土壤电导率和有机质含量均极显著高于对照(P<0.01)。

表2 土壤因子的差异比较

2.3 土壤微生物差异分析

2.3.1微生物物种组成 为研究退化人工草地土壤细菌群落和真菌群落组成成分,分别在门水平和属水平对其进行比较(图2)。在门水平上,退化人工草地土壤细菌群落(图2a)中变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimomadetes)为主要优势菌门,其相对丰度超过1%。施有机肥处理的细菌群落中变形菌门和厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度高于对照,相对丰度分别为30.02%,8.13%;在细菌门水平上,绿弯菌门(Chloroflexi)、巴纽尔斯菌门(Balneolaeota)、螺旋体门(Spirochaetes)丰度在施有机肥组与不施有机肥组间差异显著(P<0.05),念珠菌(CandidatusSaccharibacteria)丰度在两组间差异极显著(P<0.01);细菌群落在属水平上(图2b),主要优势菌门由微小杆菌属(Exiguobacterium)、Gp6、Pseudomonas、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)组成。其中,Exiguobacterium在施肥处理时丰度最高,达到了7.42%;Gp6,Sphingomonas以及Gp4平均丰度分别是6.55%,4.09%和3.22%。在细菌属水平上,Gp7的丰度在施有机肥组与对照组间差异显著(P<0.05)、不动杆菌属(Acinetobacter)的丰度在两组间存在极显著差异(P<0.01)。

图2 土壤中细菌群落(2a)和真菌群落(2c)门水平组成分析,细菌群落(2b)和真菌群落(2 d)属水平组成分析

真菌群落组成中,在门水平上,真菌群落(图2c)中子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)为主要优势菌门,其相对丰度超过1%。在真菌门中Basidiomycota的相对丰度高于对照,相对丰度为20.78%。在真菌属水平上(图2d)排在前四位的属有光黑壳属(Preussia)、白冬胞酵母属(Leucosporidium)、梭菌属(Cristinia)、粉孢菌属(Podospora)。Podospora和Pyrenophora在施肥处理后分别下降了55.69%和27.66%。

2.3.2细菌和真菌α多样性 在施有机肥和对照的10个样本中,检测到土壤细菌4 371 890条序列,真菌2 652 449条序列,在97%的相似性水平下,10个样本得到11 890个细菌OTU,2 313个真菌OTU。对土壤细菌的α多样性进行分析,结果发现退化人工草地中土壤细菌和真菌的Observed Richness指数、Shannon指数、Inverse-simpson指数、Pielou-evenness指数、Simpson-evenness指数和Chao1指数在两组间差异均不显著(表3)。

表3 细菌和真菌α多样性

2.3.3细菌和真菌β多样性 为研究施有机肥与对照样地土壤细菌群落和真菌群落的β多样性,基于Bray-curtis和Jaccard距离及MRPP,ANOSIM,PERMANOVA三种方法的检验,结果表明组间差异显著(P<0.05)。Dissimilarity分析(表4)得出相同的结论,且真菌群落用ANOSIM方法检验结果显示,在施有机肥和对照之间差异极显著(P<0.01),这一结果说明施有机肥改变了土壤细菌和真菌群落的β多样性。

表4 人工草地土壤细菌和真菌群落的不相似性检验

2.4 环境因子与细菌和真菌群落结构相关性

土壤是土壤微生物的基质,土壤的理化性质和营养物质对于土壤中微生物的群落变化具有重要的作用[20],为研究人工草地施有机肥后土壤细菌群落与环境因子之间的相关关系,采用Partial Mantel test进行检验,结果(表5)表明,在细菌群落中发现地上生物量、全氮、硝态氮与细菌显著相关关系(P<0.05),相关系数分别为r=0.702,r=0.233,r=0.433。在真菌群落中发现植被高度和铵态氮与真菌存在显著相关关系(P<0.05),相关系数分别为r=0.725,r=0.041。

表5 土壤细菌和真菌群落差异与环境因子的Partial Mantel检验

2.5 土壤细菌和真菌群落功能预测

土壤微生物群落功能直接影响着生态系统的稳定与功能的发挥,本研究使用FAPROTAX对人工草地中细菌和真菌群落的功能进行预测,并用TBtools软件做热图。图3a显示了所测样本中细菌群落功能注释结果,统计分析了相对丰度较高的13类预测功能。结果显示施用有机肥和对照处理在功能预测结果显示,除硝化作用(Nitrification)和好氧氨氧化作用(Aerobic ammonia oxidation)相对丰度较高外,其他预测功能相对丰度均较低,且差异不显著。图3b显示了所测样本中真菌群落功能注释结果,统计分析了相对丰度较高的20类预测功能,其中有6类被标记为腐生营养型、9类为共生营养型、5类为病理营养型。由图3b可知,与对照相比,施用有机肥后未定义腐生真菌(Undefined saprotrophs)的相对丰度提高,而排泄物腐生真菌(Dung saprotroph)、植物病原真菌(Plant pathogen)的相对丰度降低,其他真菌群落的相对丰度变化均呈现较低水平,且差异均不显著。这表明,在退化人工草地上,施有机肥可能减弱细菌群落的硝化作用和好氧氨氧化作用,增强真菌群落的腐生营养型真菌作用。

图3 土壤细菌和真菌群落功能预测

2.6 施有机肥对土壤微生物单边网络的特征

做土壤微生物单边网络时,为达到网络分析的要求,每个样方采土样2次,分别为10个生物学重复。对施有机肥和对照的16S,ITS测序结果构建了单边网络(图4),研究施有机肥对人工草地土壤微生物群落相互作用的影响,采用相似的阈值构建不同处理土壤细菌和真菌的单边网络,比较网络的拓扑结构系数。从表6可知,细菌群落中,施有机肥(F)的处理(节点=610,连接=10 703)相较对照(CK)(节点=1793,连接=49 728)网络规模更小,这表明施有机肥后细菌群落网络结构的稳定性可能更低,而对于真菌网络,施有机肥(F)的处理(节点=317,连接=1 289)相较对照CK(节点=297,连接=645)网络规模更大,这说明施有机肥后真菌群落网络结构的稳定性较高(表7)。此外在细菌群落网络中,施有机肥的正相关关系是88.65%,负相关关系11.37%;对照的正相关关系是55.72%,负相关关系44.28%。在真菌群落网络中,施有机肥的正相关关系64%,负相关关系36%;对照的正相关关系66.38%,负相关关系33.63%。

表6 单边网络属性

图4 单边网络可视化

用Zi-Pi图显示了基于模块的拓扑角色空白(CK)和施有机肥(F)处理土壤中OTUs的分布(图5)。根据简化分类,在阈值Zi = 2.5,Pi = 0.62处,网络内所有节点都属于模块中心点(Module hubs)、连接节点(Connectors)、网络中心点(Network hubs)、外围节点(Peripherals)四个子类别。来自CK和F处理网络的许多节点(> 97%)被归类为外围节点,它们只有很少的交互,通常连接到自己模块中的节点。在细菌网络中,CK处理的变形菌门(OTU_1611和OTU_1456),未识别类(OTU_778和OTU_883)为模块中心点。施有机肥(F)处理后,芽单胞菌门(OTU_488和OTU_588)为模块中心点。在真菌群落的网络中,CK处理的担子菌门(OTU_2497)为模块中心点,而有机肥(F)处理后网络中无模块中心点。

图5 OTU根据其拓扑作用的Zi-Pi分布图

3 讨论

在退化人工草地施有机肥后,对植被盖度、高度、生物量、物种数、重要值和植物群落物种多样性等指标都有一定的影响。研究显示,施有机肥刺激了植物的生长,提高草地生产力[21],提高草地生物量水平[22]。宋君祥等[23]研究发现施有机肥能提高植株高度、盖度,增加物种数量,改善植物群落结构并提高群落稳定性。施有机肥后,退化人工草地的盖度、高度、生物量、物种数均增高,这与陈积山等[24]的研究结果一致。另外,土壤湿度在施有机肥后有所增加,原因可能是有机肥施用提高土壤的保水保肥能力,土壤结构更加稳定,利于土壤水肥协调供应[25-26],进而增加了土壤湿度。土壤电导率在施有机肥后增加显著,是因为施有机肥改善了退化人工草地植被状况,植被高度、盖度和地上生物量有所增加[27]。土壤有机质在施有机肥后显著增加,原因是施用有机肥可增加土壤微生物群落和多样性,提高土壤有机质(SOM)及溶解性有机质(DOM)含量[28]。表明有机肥施用对退化草地植被和土壤具有一定的改良作用,长期施用后对培肥地力具有重要意义。

施有机肥当年土壤细菌群落组成以变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)等为主要优势菌门,这与张杰雪等[29]的研究结果相似。真菌群落组成以子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)为主要优势菌门,这与高雪峰等[30-31]的研究结果相一致。本研究检测出的细菌OTU数以及种类均高于真菌的,表明高寒地区退化人工草地土壤微生物类群以细菌为主,这与杨希智等[32]有关高寒草地土壤微生物的研究结果一致。真菌多样性和丰富度分析结果显示,施用有机肥高于对照草地,这与植物群落多样性对土壤微生物的影响结果相同,植物群落多样性增加可以提高土壤微生物多样性[33]。土壤微生物数量和多样性的大小是表征土壤肥力状况的重要生物学指标之一,土壤养分与微生物生物量呈正相关[34]。薛凯等[35]的研究发现,铵态氮和速效磷与土壤微生物的多样性有显著的相关性,齐文娟等[36]的研究也证实了总氮与速效磷对土壤微生物影响显著,这与本文的结果相一致。

运用FAPROTAX对土壤细菌功能类群进行研究,结果显示比例较高的功能类群有好氧氨氧化型、硝化作用等。施用有机肥与对照处理下的土壤细菌功能之间差异不显著。这与郭城[37]的研究结果相似,有机肥可以为土壤提供更均衡和稳定的营养供应,促进它们生长繁殖[38],促进土壤中氮素养分的维持[39]。用FUNGuild对土壤真菌群落功能进行预测分析,主要以腐生营养型和病理营养型为主,这与Nguyen等[40]的相关研究结果相似。本研究中,施有机肥后人工草地中,病理营养型真菌群落的丰度有所降低,表明土壤的养分管理实践对增加有益共生真菌的相对丰度有积极影响,同时降低了潜在病原真菌群落的相对丰度[41]。施有机肥改善了土壤微生物群落功能组成,改善土壤微生物有益菌群比例,提高土壤恢复质量。

利用单边网络对施有机肥后土壤微生物群落的相互作用关系进行了分析,网络中存在的节点和边代表了网络的规模以及关系复杂程度[42]。网络结构中微生物间正相关代表着互惠关系,而负相关则代表着竞争关系[43]。施有机肥后,细菌的网络规模减少了,但是与对照相比,其正相关关系显著增加,说明细菌群落内部的互利共生关系显著增强。对于真菌群落,施有机肥增加了网络规模,网络节点和连接数更高,说明真菌群落间的关系更复杂,网络更稳定。模块中心点被认为是土壤微生物网络的关键节点[44]。在施有机肥条件下,不同的OTU被分配到不同的模块中,表明施有机肥会改变土壤微生物群落的网络关键微生物种群。在细菌群落中,施肥后的核心微生物由不施肥的变形菌门转换成芽单胞菌门,芽单胞菌门能够适应各类干旱环境,能够参与基本的生物过程[45],这表明微生物的改变可能会改善土壤的生态功能。

4 结论

施有机肥对退化人工草地的植被恢复有促进作用,显著增加了植被盖度的同时,群落的高度、地上生物量及物种数也有所增加。施有机肥当年,改变了土壤真菌和细菌群落结构和潜在功能,降低了具有硝化作用和好氧氨氧化作用能力的细菌群落相对丰度和病理营养型真菌群落的相对丰度,促进了土壤有益菌群的发展,改良了土壤理化性质,改善了退化人工草地的植被状况。同时也增大了退化草地土壤微生物生态网络的规模,增进了正相关关系,改变了组成微生物网络的核心物种,因此施有机肥是修复退化人工草地土壤微生物群落结构、微生物群落多样性及微生物间互作关系的有效措施,这可能对监测退化人工草地的生态系统功能具有重要意义。