可注射浓缩生长因子凝胶在恒牙牙髓再生中应用的实验研究

王明浩，郭 倩，张轶丹，朱小苗，蒋文凯，王胜朝，何文喜(口颌系统重建与再生全国重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔医学重点实验室，空军军医大学口腔医院牙体牙髓病科，陕西 西安 7003；空军特色医学中心口腔科，北京 004)

牙体牙髓病是一类不可逆性牙体组织疾病，病变波及牙髓时可能引发牙髓炎症，继而导致感染坏死，给患者带来极大的疼痛感，影响生活质量。目前临床治疗中对于不可复性牙髓炎和根尖周炎仍以根管治疗为主要手段，经过机械性根管预备后，根管壁变薄，根折风险变大[1-2]，同时，由于治疗过程中患牙牙髓被完全拔除，牙齿失去了牙髓的营养功能[3-4]，更加大了这一风险。

基于干细胞、支架材料和生长因子的牙髓再生是目前组织工程领域的研究热点之一。在早期探索中，研究者通过血运重建的方法诱导牙髓再生[5-6]，但根管钙化阻塞是导致其失败的重要原因之一。近年来，许多研究尝试通过牙髓干细胞直接移植诱导牙髓再生[7-12]，并在乳牙牙髓再生中取得了较好的效果[8，12]，但移植牙髓干细胞对恒牙牙髓再生的效果并不理想[7，9-11]。同时，尽管牙髓干细胞是较易获得的干细胞来源，但在实际的临床应用中仍存在体外培养及干细胞来源的伦理问题。因此，仅通过移植支架材料和生长因子诱导牙髓再生的细胞归巢方法成为了新的研究热点，并有研究证明细胞归巢诱导牙髓再生具有可行性[13-14]。

浓缩生长因子(concentrated growth factors，CGF)是第三代自体血小板凝聚物，由外周血变速离心获得，血液中的纤维成分和生长因子在离心后位于离心管的上清液层，富集的纤维成分成为牙髓再生的天然支架，其对生长因子的储留可以起到缓释生长因子的作用。本研究中所使用的CGF为可注射的液态凝胶，同时添加了离心后血细胞层与上清液层之间少量的CD34+细胞，具有促进组织再血管化的作用，而新生血管的长入更有利于组织再生[15-17]。

本研究通过采集比格犬自体外周静脉血制备可注射CGF凝胶，将其应用于犬恒牙牙髓再生，既保留了CGF作为牙髓再生天然支架、缓释生长因子的作用，又简化了牙髓再生的操作。同时，CGF的应用与根尖引血联合，探索在恒牙牙髓再生中新生组织矿化与牙髓样组织再生之间的平衡。

1 材料与方法

1.1 材料

iRoot-BP Plus(IBIOCERAMIX，加拿大)；流动树脂(3M，美国)；HE染色试剂盒(碧云天，中国)。根管预备机(啄木鸟，中国)；CGF离心机(Silfradent，意大利)；倒置显微镜(Leica，德国)。

13月龄雄性比格犬，前牙已萌出，牙根发育完全。实验动物购自北京玛斯生物技术有限公司，动物生产许可证号为SCXK(京)2021-0002，动物使用许可证号为SYXK(陕)2020-004。实验动物伦理已获得空军军医大学口腔医院伦理委员会批准[许可证号：2021伦审字(kq-007)号]。

1.2 方法

1.2.1 比格犬牙髓感染模型建立 比格犬术前禁食、水12 h，以速眠新(846合剂，60 μL/kg)与戊巴比妥钠(30 g/L，0.5 mL/kg)复合肌肉注射麻醉，术前拍摄上下颌前牙X射线片(12颗前牙)。喷水条件下，使用高速涡轮机将比格犬前牙颊侧面磨除部分牙釉质和牙本质，可见透红后停止，保持7 d建立牙髓感染模型。

1.2.2 可注射CGF凝胶制备 可注射CGF凝胶制备前启动Medifuge离心机自消毒程序，进行紫外消毒。用负压采血管取犬前肢静脉血9 mL，配平后置于Medifuge离心机中，在CGF程序下通过一次变速离心(2 700、2 400、2 700、3 000 r/min)分离血液成分。用3 mL注射器抽取绿色采血管中红黄交界处0.5 mL CD34+，用1 mL注射器抽取最上层2 mL贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)备用。取下三通中的较长端堵头备用，将三通帽安装在1 mL注射器上，置于已预热好的恒温仪中，在75 ℃条件下加热10 min，降温后将放凉的凝胶和0.5 mL CD34+导入5 mL注射器中，安装另一个5 mL注射器进行混匀，约30次，最终得到可注射CGF凝胶。

1.2.3 比格犬牙髓再生治疗 实验分为4组，分别为空管组、根尖引血组、CGF组、根尖引血+CGF组。

比格犬上下颌前牙上橡皮障，消毒后在冲水条件下开髓，用拔髓针将比格犬牙髓完整拔除(图1A)，25# K锉提拉根管壁(图1B)，机用单支锉根管预备；超声震荡后用12.5 g/L次氯酸钠5 mL和170 g/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)5 mL交替冲洗根管(图1C)，20 mL生理盐水再次冲洗根管后使用无菌纸捻吸干根管内水分；25# K锉将根尖孔贯穿，并扩大至40# K锉，保持根尖组织与根管间开放。根据实验分组进行根管充填(图1D)，其中空管组仅根管预备，不做充填；根尖引血组使用无菌25# K锉刺激根尖出血至根管口下1～2 mm；CGF组将CGF凝胶注射至根管口下1～2 mm；根尖引血+CGF组根尖刺激出血至根管内根方1/2处，然后将CGF凝胶注射至根管口下1～2 mm，所有组iRoot-BP Plus封闭根管(图1E)，冠部充填流动树脂并抛光(图1F)，每周检查牙冠封闭情况。

A：去髓；B：根管预备；C：冲洗；D：注射CGF凝胶；E：iRoot-BP Plus封闭根管口；F：流动树脂充填。图1 比格犬牙髓再生操作流程

1.2.4 术后取材 所有实验牙均封闭完整，根尖对应黏膜无溃疡、瘘管。3个月后，通过颈动脉对比格犬进行灌注，将上下颌骨完整取下，浸于40 g/L多聚甲醛中固定3 d后，使用170 g/L EDTA，37 ℃恒温条件下脱钙，每周更换脱钙液，6个月后脱水透明，石蜡包埋切片，进行HE染色，倒置显微镜下观察。

2 结果

2.1 可注射CGF凝胶的外观

比格犬外周静脉血离心后呈分层状，上清液层自上而下分别为血清层、PPP层、富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)层，中间层为CD34+细胞层及CD34+细胞与血细胞混合层，下层为血细胞层(图2A)。将抽取的PPP置于75 ℃恒温加热仪中加热20 min后取出降至室温，与CD34+细胞混匀后，CGF呈红色凝胶状(图2B～C)。

2.2 比格犬根尖情况及牙髓再生的组织学观察

2.2.1 影像学检查 术前及术后3个月对比格犬上下颌前牙进行根尖X射线检查，术前X射线显示比格犬上下颌前牙牙根已发育完全，根尖孔闭合，无根尖阴影(图3A1、B1)；术后3个月根尖X射线显示牙冠处封闭良好，未见明显根尖阴影，上颌前牙根尖周膜腔略增宽，骨硬板边缘模糊(图3A2、B2)。

A1：术前上前牙X射线片；A2：术后3个月上前牙X射线片；B1：术前下前牙X射线片；B2：术后3个月下前牙X射线片。图3 比格犬术前及术后3个月前牙根尖X射线片

2.2.2 组织学染色 比格犬牙齿石蜡切片HE染色显示，正常牙髓组织中成牙本质细胞呈栅栏状，沿牙本质壁整齐排列，成牙本质细胞层、多细胞层、乏细胞层清晰可见(图4A)；空管组根管内仅见少量组织贴附于根尖1/3处的根管壁上，根尖孔通畅，未形成根尖封闭(图4B)。

A：正常牙髓组织；B：空管组根管组织。黑色箭头示牙本质；黄色箭头示成牙本质细胞层；蓝色箭头示乏细胞层；红色箭头示多细胞层；绿色箭头示未封闭的根尖孔。图4 正常牙髓与空管组HE染色组织学观察

除空管组外，根尖引血组(图5A～B)、CGF组(图5C～D)和根尖引血+CGF组(图5E～F)根管内均有新生组织产生并伴有不同程度的矿化。根尖引血组新生组织可达根管内约1/2处，以骨样组织为主，上部为少量疏松结缔组织并伴有血管化，根管下部新生骨样组织阻塞根尖孔，可见新生组织中存在骨陷窝样结构(图5A～B)。CGF组根管内新生组织以疏松结缔组织为主，可达根管内约2/3处，新生组织内存在大量血管样结构，越接近根尖处，血管样结构越丰富；根管内根方1/3处形成新生牙本质样结构，促进根管壁增厚，高倍镜下可见成牙本质样细胞存在；矿化组织仅存在于新生软组织上部中央(图5C～D)。根尖引血+CGF组根管内可见牙本质样组织贴附于根管壁上，其间散在分布成牙本质样细胞；新生疏松结缔组织与健康牙髓组织相似，可见多细胞层、乏细胞层，并存在均匀分布的血管结构；根管冠方与iRoot-BP Plus接触位置形成矿化桥，将新生牙髓样组织包裹在内(图5E～F)。

A～B：根尖引血组；C～D：CGF组；E～F：根尖引血+CGF组。黑色箭头示牙本质；白色箭头示新生牙本质及包埋其中的成牙本质样细胞；红色箭头示血管；黄色箭头示类成牙本质细胞层；浅蓝色箭头示乏细胞层；绿色箭头示钙化组织；橙色箭头示iRoot-BP Plus；棕色箭头示多细胞层；紫色箭头示结缔组织；蓝色箭头示骨陷窝。图5 根尖引血组、CGF组、根尖引血+CGF组HE染色组织学观察

3 讨论

牙髓再生是牙体牙髓病学及组织工程研究中的重要方向之一，恢复与正常牙齿中相似的牙髓-牙本质复合体并实现牙髓组织的功能是牙髓再生研究的最终目的。目前，对于恒牙牙髓缺失，仍以传统的根管治疗为主，在这一过程中，机械性根管预备使原有牙本质变薄，同时失去牙髓组织的营养作用，导致根折的风险增大[1-2]。干细胞移植和细胞归巢被认为是牙髓再生的可能途径，近年来的研究中，通过牙髓干细胞直接移植[7-8，10-12]、刺激根尖出血形成血凝块和根管内注射PRP[6，18-19]等方法在根管内诱导形成的新生组织仍存在一些不足，新生组织不具备牙髓的基本结构，其间分布的钙化团块阻塞根管，远期预后不佳。

CGF是第三代自体血小板凝聚物，采集外周血后通过离心获得，不添加外源性物质，避免引发机体的免疫排斥反应，除此之外，变速离心将血液中的细胞分离出来，纤维成分和生长因子进一步富集[20-21]。包括成纤维生长因子、表皮生长因子、血小板源性生长因子、转移生长因子、类胰岛素生长因子等在内的多种生长因子对干细胞的迁移和分化均具有重要影响[22-23]，同时在CGF内纤维成分的储留作用下，这些生长因子可以发挥更长效的作用[24-25]。在组织工程领域研究中，CGF与自体骨或人工材料的结合已广泛用于引导骨再生并取得良好疗效[24-25]。本研究中所使用的CGF中添加了CD34+细胞，研究证明，CD34+细胞在组织再血管化过程中发挥重要作用[15-17]。

本实验中HE染色结果显示，空管组根尖有少量结缔组织存在，而根管内未见新生组织长入，根尖孔仍保持开放；未发现空管组根管内感染的发生，这表明牙髓再生前的根管预备可以有效对根管内进行消毒，为实验组的牙髓再生创造无菌环境。2004年，BANCHS等[5]提出牙髓再血管化的概念，即通过根尖孔引入血液，诱导根尖周组织中存在的干细胞进入根管，以血凝块为支架，在牙髓缺失的根管内产生血管、神经等代替牙髓组织，使牙根继续发育。根尖引血组刺激根尖出血至根管口下1～2 mm处，结果显示根管内多为钙化组织阻塞，这与DIOGENES等[26]的研究结果相似，其原因可能是根尖周来源的血液中部分成分对成骨具有促进作用，导致了过度钙化的发生。CGF组根管内新生组织接近根管全长，以牙髓样组织为主，含有少量钙化组织，证明CGF本身即可发挥诱导牙髓再生的作用；新生牙髓样组织中含有丰富的血管结构，表明CD34+细胞在组织再血管化中发挥促进作用。同时，根管壁的增厚及成牙本质样细胞在牙本质样组织中的沉积提示CGF促进根尖周干细胞的迁移和分化，然而，新生牙本质样组织存在于根尖1/2，根管中上部仅可见部分成牙本质样细胞贴附于根管壁上，延长比格犬牙髓再生的术后取样时间可能观察到新生牙髓样组织充满根管空间以及更多牙本质样组织的形成。根尖引血+CGF组的结果显示，在刺激根尖出血的同时应用CGF可能形成更好的牙髓再生效果，新生牙本质样组织与根管上部的钙化桥沿根管壁排列，其中包裹的牙髓样组织已初步具备正常牙髓的组织结构，多细胞层、乏细胞层、分布均匀的血管结构清晰可辨，尽管根尖1/3由新生牙本质样组织阻塞，但这与根尖引血组的钙化结节仍有不同之处，根尖引血+CGF组根尖部分的矿化组织更加均匀，其间成牙本质样细胞的散在分布与根尖引血组的骨陷窝也有不同。

综上所述，CGF对诱导根管内牙髓再生具有促进作用，单独应用CGF时即可诱导根管内牙髓样组织再生。临床中牙髓血运重建的结果和本研究中根尖引血组诱导牙髓再生均表明血液中的部分成分对矿化形成具有促进作用，然而，根尖引血组与CGF联合时根管内牙髓样组织的形成和矿化的发生似乎达到了平衡，进而形成了类似牙髓-牙本质复合体的结构。在后续研究中，调整两者相互结合的比例有望实现根管内局部的矿化和以牙髓样组织为主的牙髓再生。