黑斑蛙视网膜3种神经内分泌细胞的免疫组织化学定位

詹 厅 李 晋 戴光云 张盛周

(安徽师范大学生命科学学院,芜湖 241000)

黑斑蛙视网膜3种神经内分泌细胞的免疫组织化学定位

詹 厅 李 晋 戴光云 张盛周＊

(安徽师范大学生命科学学院,芜湖 241000)

目的 研究神经肽 Y(NPY)、五羟色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)免疫阳性细胞在黑斑蛙(Rana nigromaculata)视网膜上的组织学定位。方法 应用过氧化物酶标记的链霉亲和素(SP法)免疫组织化学技术,并结合生物统计学分析。结果 NPY细胞主要分布于内核层和节细胞层。内核层中出现两种阳性细胞,一种出现在第2、3亚层,常为多个细胞聚集;另一种出现在内侧,有突起伸入内网层。节细胞层阳性细胞分布较少,胞体有大小之分。5-HT细胞主要分布于内核层和节细胞层,位于内核层中邻近内网层一侧的阳性细胞有突起延伸入内网层。GLU细胞分布于外核层、内核层内侧以及节细胞层。结论 黑斑蛙视网膜上NPY、5-HT和 GLU细胞的分布与其它物种有相似之处,也有其自身特点,符合其晨昏性生活习性。

黑斑蛙;视网膜;神经肽Y;5-羟色胺;胰高血糖素

神经内分泌细胞(Neuroendocrine cells, NECs)是一类含神经递质、神经调质或神经肽类激素的细胞,广泛分布于机体各类器官组织中,参与多种调节作用[1]。研究表明,各类脊椎动物视网膜中均存在多种神经内分泌细胞,但不同物种视网膜神经内分泌细胞的分布、密度和形态均存在较大种间差异[2-12]。黑斑蛙(Rana nigromaculata)俗称田鸡,属两栖纲无尾目蛙科。在我国分布很广,属两栖类的优势种群,具有重要的生态价值和经济价值,也是重要的科研和教学用实验动物。目前对黑斑蛙视网膜的组织结构已有研究[13],但其视网膜神经内分泌细胞方面的资料尚缺。本研究探讨了神经肽Y(NPY)、五羟色胺(5-HT)和胰高血糖素(GLU)细胞在黑斑蛙视网膜上的分布和形态,旨在丰富比较内分泌学知识体系,增进对黑斑蛙视觉生理的认识,为该物种的生态保护和人工养殖提供基础资料。

材料和方法

1.材料

鲜活的成体黑斑蛙10只,采自芜湖市市郊,重70-95g,双毁髓后迅速取下完整眼球。整体Bouin’s液固定5-7d后,去除眼球前半部分,小心将视网膜拨出。常规脱水透明,石蜡包埋,切片(5-7μm),贴片。

2.主要试剂

神经肽 Y(Neuropeptide Y,NPY)兔抗血清购自武汉博士德生物工程有限公司,五羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)和胰高血糖素(Glucagon,GLU)兔抗血清为美国ZYMED公司产品。链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(Streptavidin Peroxidase,SP)免疫组织化学试剂盒购自北京中山生物技术公司。

3.免疫组织化学方法

常规石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2甲醇溶液孵育5min,消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水浸洗,PBS浸泡 5min,滴加正常山羊血清(1: 10)室温孵育10min,封闭非特异性反应部位。倾去血清,滴加一抗,4℃过夜。PBS浸洗3次× 5min,滴加即用型生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗血清),室温孵育1h。PBS浸洗3次×5min,滴加即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶,室温1h。PBS浸洗 3次×5min,DAB-H2O2显色,自来水洗净,脱水,透明,封片。阴性对照分别用正常羊血清和PBS代替一抗,其余步骤同上。

4.观察与计数

在德国莱卡DM2500型显微镜下观察、拍照。免疫阳性细胞呈棕黄色,背景呈浅蓝或淡黄色。对每例视网膜切片随机取10个单位面积(100μm× 100μm)进行细胞计数,取平均值(±s)表示阳性细胞的分布密度。用SPSS软件独立样本 T检验进行比较分析。

结 果

光学显微镜下,黑斑蛙视网膜具有典型的十层结构,由外向内依次为色素上皮层、视杆视锥层、外膜层、外核层、外网层、内核层、内网层、神经节细胞层、神经纤维层和内膜层(图 1)。视网膜上免疫阳性细胞呈深棕色,背景呈浅蓝或淡黄色,容易区分。

1.NPY细胞

NPY免疫阳性细胞主要分布于内核层和节细胞层,总体分布不均。内核层阳性细胞平均密度为39.5±13.7个/mm2,节细胞层为 5.5±2.5个/ mm2。两层分布密度有显著差异(P<0.05)。其中内核层阳性细胞可分为两种类型,一种发生于内核层的外侧及第2、3亚层(S2、S3),常为2-3个圆形细胞聚集,胞体较小,直径为5-10μm,阳性较强,胞体周围有突起(图2a)。另一种出现在内核层中邻近内网层的一侧,呈圆形或卵圆形,胞体亦较小,阳性较弱,并且多数胞体周围有突起伸入内网层的外侧(图 2b),形态上观察为无长突细胞。偶尔可见突起伸入内网层第1亚层(S1)后再分出小分枝延伸至内网层第3亚层(S3)(图2b)。节细胞层阳性细胞密度较小,细胞呈圆形,胞体有大小两种,直径分别为 10-12μm和 20-25μm,形态上可判断为移位的无长突细胞(图2a,2b)。

2.5 -HT细胞

5-HT免疫阳性细胞主要分布于内核层和节细胞层,分布不均。内核层平均密度为37.5±10.1个/mm2,节细胞层平均密度为 12.5±6.4个/ mm2,两层分布密度有显著差异(P<0.05)。内核层阳性细胞主要位于邻近内网层的一侧,胞体为圆形或椭圆形,胞外突起延伸入内网层不同亚层。节细胞层阳性细胞密度较小,细胞多呈圆形(图3)。

3.GLU细胞

GLU免疫阳性细胞主要出现在外核层、内核层内侧和节细胞层。外核层与内核层阳性细胞分布较均一,平均密度分别为 17.5±5.4个/mm2和31.2±7.4个/mm2;节细胞层数量较少,主要分布偏于中央区域,平均密度为7.5±3.2个/mm2。三层分布密度无显著差异(P>0.05)。各层阳性细胞多数呈圆形或椭圆形,其中内核层阳性细胞分布于内侧,邻近内网层,胞外可见突起伸入内网层;节细胞层阳性细胞胞体较大,胞外有突起伸入内网层(图4)。

在内核层和节细胞层内分别对以上3种免疫阳性细胞的分布进行两两比较,结果显示均无显著差异(P>0.05)。

讨 论

脊椎动物视网膜具有十层基本结构。大多数动物NPY细胞主要分布于内核层和节细胞层,如蜥蜴、小鼠、大鼠等[2-4],黑斑蛙与这些动物相一致。不过,人类视网膜中NPY免疫阳性反应多发生在网状细胞层[5]。蟾蜍仅分布于内核层,节细胞层未见[6]。牛蛙则除内核层外,外核层亦有较强的阳性反应,且节细胞层阳性细胞体积较小[7]。黑斑蛙外核层未发现有阳性反应,且节细胞层阳性细胞体积较大。黑斑蛙 NPY细胞密度远小于小鼠和大鼠[3,4],与蟾蜍相当[6]。5-HT和 GLU在视网膜中的分布研究较少。鸡视网膜5-HT细胞主要分布于内核层,延伸入内网层[8]。牛蛙视网膜5-HT细胞位于内核层1/3外侧端和最内侧[9]。本研究则发现黑斑蛙视网膜5-HT细胞主要集中于内核层内侧。之前有研究显示蛙类节细胞层和内网层中存在GLU细胞,未提及内核层[10]。东方蝾螈 GLU细胞主要分布于网间细胞层,即一面有突起伸入外网层,另一面穿过内核层伸入内网层[11]。本研究显示黑斑蛙GLU细胞主要出现在外核层和内核层内侧,节细胞层亦有少量分布。综上可见,黑斑蛙视网膜NPY、5-HT和GLU细胞的分布与其它物种有相似之处,也有其自身特点,具有明显的种间特异性。

研究表明,黑斑蛙视网膜的组织结构与其晨昏性生活习性是相适应的[13]。体内外实验表明NPY和5-HT参与了昼夜节律的调节[12,14],提示NPY和5-HT可能与动物的昼行性与夜行性有关。黑斑蛙视网膜NPY和5-HT细胞的分布及密度与夜行性鼠类和昼行性人类均有较大差别,这种差异亦可能与其晨昏性生活习性有关,有待进一步的研究。

NPY在开始分析有结构的视觉信息时出现表达峰值[15],暗适应条件下鸡视网膜中5-HT浓度增加[8],说明NPY和5-HT与视觉形成有关。但本研究显示NPY和5-HT并没有分布于黑斑蛙视网膜感光层,推测其只是作为一种调节因子或神经递质,接收来自感光层的信号。5-HT可能在生物钟中起神经递质作用[14],NPY可以诱导5-HT在视网膜上的释放[16]。GLU与视觉散焦有关[17],鸡及本研究的黑斑蛙视网膜GLU细胞均在外核层中有分布,提示其可能参与了感光机能[18]。此外, GLU能诱导视网膜上cAMP的形成[19],而NPY则能抑制其形成[15]。本研究显示 GLU与NPY均在内核层、节细胞层中有分布,推测二者可能是在内核层及节细胞层内通过双向控制cAMP来共同调控视网膜的某些机能。可见,NPY、5-HT和 GLU对视觉的形成均起着重要作用,并且三者之间关系密切,共同参与对视网膜功能的调节。

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图 版 说 明

图1 视网膜组织结构,示视网膜10层结构。PE:色素上皮层;RCL:视杆视锥层;OLM:外界膜;ONL:外核层;OPL:外网层;INL:内核层;IPL:内网层;GCL:节细胞层;NFL:神经纤维层;ILM:内界膜。HE染色,标尺=50μm。

图2 NPY阳性细胞主要分布在内核层和节细胞层。内核层中出现两种阳性细胞,一种为多个细胞聚集(图2a,↑↑),另一种出现在内核层内侧,有突起伸入内网层(图2a,2b,▲),有些突起伸入内网层 S3(图2b,△△);节细胞层阳性细胞分布较少,胞体有大小两种(图2a,小胞体;图2b,大胞体;↑)。SP法,标尺=50μm。

图3 5-HT阳性细胞分布于内核层和节细胞层。分布于内核层中邻近内网层一侧有突起伸入内网层(▲)。节细胞层有少量分布(↑)。SP法,标尺=50μm

图4 GLU阳性细胞分布于外核层(△)、内核层(▲)和节细胞层(↑)。内核层有突起伸入内网层。SP法,标尺=50μm。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The histological structure of the retina ofRana nigromaculata,showing 10 layers structure.PE:Pigment epithelia layer;RCL:Cones and rods layer;OLM:Outer limiting membrane;ONL:Outer nuclear layer;OPL:Outer plexiform layer;INL:Innernuclearlayer;IPL:Innerplexiform layer;GCL:Ganglion cell layer;NFL:Nerve fibers layer;ILM:Inner limiting membrane.HE staining, Scale=50μm.

Fig.2 NPY positive cells are localized in INLand GCL.There are two types of cells in the INL.The cells of one type are usually collected each other(2a,↑↑).The other type is found in the inner part of the INLwith the processes ramified into IPL(2a,2b,▲),while some ramified into S3 ofIPL(2b,△△).Less cells are found in the GCLwith small or large cell bodies(2a,small,↑;2b,larger,↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.3 5-HT positive cells are present in INLand GCL.The cells in the INLare close to INL/IPLborder with their processes to the IPL(▲).Less cells are found in the GCL(↑).SP method,Scale=50μm.

Fig.4 GLU positive cells are localized in ONL(△),INL(▲)and GCL(↑).In the INL,their processes are ramified into the IPL.SP method,Scale = 50μm.

IMMUNOHISTOCHEMICALLOCALIZATION OF THREE TYPES OF NEUROENDOCRINE CELLS IN THE RETINA OFRANA NIGROMACULATA

Zhan Ting,Li Jin,Dai Guangyun,Zhang Shengzhou＊
(College of Life Science,Anhui Normal University,Wuhu241000,China)

Objective To investigate the histological localization of neuropeptide Y(NPY),5-hydroxytryptamine(5-HT)and glucagon(GLU)immunohistochemical positive cells in the retina ofRana nigromaculata.Methods Streptavidin peroxidase(SP)immunohistochemical method was used with biological statistical analysis.Results NPY cells were mainly localized in the inner nuclear layer(INL)and the ganglion cell layer(GCL).Two types of cells were found in the INL.One lay in strata 2 and 3(S2, S3),usually in clusters.The other was in the inner part of the INL,with their processes ramified into the inner plexiform layer(IPL).In the GCL,the positive cells were scattered with different sizes.The 5-HT cells were present in the INLand GCL.The cells in the INLclose to the INL/IPLborder extended their processes to the IPL.GLU cells were localized in the outer nuclear layer(ONL),INLand GCL.These cells in the INLand GCLhad their processes ramified into the plexiform layer.Conclusion Compared with other animals,there are both common and specific features in the distribution of NPY,5-HT and GLU cells in the retina ofRana nigromaculata,which is in accordance with its twilight habit.

Rana nigromaculata;Retina;Neuropeptide Y;5-Hydroxytryptamine;Glucagon

R329.3

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.009

2010-03-22

2010-06-07

安徽师范大学生物大分子进化重点实验室开放基金(2006B001),"动物生物学"安徽师范大学优秀学术团队基金,生物环境与生态安全省级重点实验室及安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室建设基金资助

詹厅,女(1984年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)