微型头戴式单光子荧光显微成像技术研究进展

付 强，张智淼，赵尚男，刘 洋，董 洋

（1.中国科学院长春光学精密机械与物理研究所, 吉林 长春 130033；2.中国科学院大学, 北京 100049）

1 引 言

在过去的几十年，神经科学得到了巨大发展，其研究方式也发生了巨大转变，脑科学研究进入到了新时代[1]。随着钙荧光指示剂的出现和不断发展，研究人员能够使用光学显微镜来直接观察生物体内的神经活动[2-5]。脑成像技术为人类了解大脑的功能以及研究各种神经疾病对大脑功能的影响及破坏提供了前所未有的帮助。但是，过去光学神经成像通常使用笨重的台式光学显微镜，这种显微镜体积庞大，需要对动物进行麻醉或固定头部，限制了能够进行的实验类型。近年来随着微型光学元件和电子设备的发展，光学神经成像设备逐渐从台式平台向“头戴式”平台转变[6]。

微型头戴式荧光显微镜能够以较高的分辨率对自由移动的动物大脑中的神经活动进行观测[7]，既可以通过颅骨开窗对大脑皮层的神经活动进行成像，也可以通过结合梯度折射率（Gradient Index，GRIN）透镜（将光学图像从一端中继到另一端）对大脑深部的神经活动进行成像，迅速增强了对大脑如何工作的理解。目前，微型头戴式荧光显微镜的主流方案是基于单光子荧光成像的微型显微镜和基于双光子荧光成像的微型显微镜。对于单光子荧光成像，荧光染料中的电子吸收激发光中的一个光子被激发到高能级，然后当电子从高能级向低能级跃迁时会发出一个比激发光波长更长的光子。单光子荧光效应比较容易发生，使用LED 作为激发光源提供宽场照明就能够得到生物成像所需的荧光信号，系统构建更加容易。但是宽场照明产生的离焦荧光会对成像质量造成影响，并且由于激发光的波长相对较短，光束散射效应也比较明显。所以微型单光子荧光显微镜的优点是成像视场更大、帧频更高、成本更低、更易于组装和维护，且允许动物有更加自由的运动行为。其缺点是穿透深度小，轴向分辨率低，图像的对比度也比较低。

对于双光子荧光成像，荧光染料中的电子需要吸收激发光中的两个光子被激发到高能级，然后当电子从高能级向低能级跃迁时会发出一个比激发光波长短的光子。因此，与单光子荧光成像相比，双光子荧光成像可以使用约二倍波长的光来提供激发光，光束的散射程度更低。但是双光子荧光效应发生的概率极低，需要使用峰值功率极高的飞秒激光作为光源，并且仅在激光束焦点处才能得到生物成像所需的荧光信号，因此需要进行逐点扫描成像，这无疑会增加系统构建的成本，但是这也避免了离焦荧光的影响，成像质量更高。所以微型双光子荧光显微镜的优点是穿透深度更大，轴向和横向分辨率更高，例如北京大学陈良怡、宗伟健等人[8]在2017 年报道的微型双光子荧光显微镜的横向分辨率为0.65 μm，轴向分辨率为3.3 μm。其缺点是系统构建更加复杂，需要昂贵的近红外飞秒激光器来提供激发光，并且还需要使用较粗的光纤束进行图像传输，对动物的行为会造成一定的影响。

从目前的期刊文献和商业报道上看，由于微型单光子荧光显微镜更容易实现和性价比更高的特点，使其成为主流。近年来，微型单光子荧光显微镜技术日趋成熟，不仅有一些开源项目推动该领域的发展，还有Inscopix、Doric 等商业公司提供完整的解决方案。因此使用微型单光子荧光显微镜对活体动物的神经活动进行成像已经成为了一种新兴的趋势，越来越受到脑科学研究者的欢迎，已经被应用到了神经科学研究的各个研究领域。

本文简要回顾了光学神经成像的发展历史，然后将目前报道的微型头戴式单光子荧光显微镜分为小视场系统（Field of View，FOV<1mm）和大视场系统（FOV>7mm），对他们使用的光学系统方案进行介绍，并分析其优缺点。最后，对微型头戴式单光子荧光显微镜目前的发展现状进行总结，对未来的发展趋势进行展望。

2 小视场微型单光子荧光显微镜

小视场微型单光子荧光显微镜（FOV<1mm）在近些年得到了巨大发展，技术日趋成熟，研究人员在设计满足荧光成像的基本功能之上，还加入了很多其他功能，例如：加入无线功能以解除电线对动物行为的限制；利用三维成像解决单光子荧光成像穿透深度小的问题；开发双区域成像功能实现同时对两个脑区进行成像；加入双色/多色成像功能解决对不同神经细胞群同时进行成像的问题。

2.1 具有基本荧光成像功能的微型荧光显微镜

2011 年，Ghosh 等人对微型荧光显微镜的发展做出了里程碑式的工作[9]，开发出了第一个完全集成的微型头戴式荧光显微镜，总重量仅为1.9 g，体积为2.4 cm3，如图1（a）所示。该显微镜由光学系统、照明LED、CMOS 探测器、结构外壳和电子线路组成。光学系统极为简单，物镜仅是一片GRIN 透镜，管镜为一片消色差双胶合透镜。照明光由LED 发出，经过收集透镜、激发滤光片、二向色镜和物镜后，照明神经细胞；激发的荧光经物镜、二向色镜、发射滤光片和管镜成像在CMOS 上。该系统的成像质量完全能与台式显微镜相媲美，光学性能数据见表1[11-14]。

图1 具有基本成像功能的系统。（a）Ghosh 等人的集成显微镜的横截面图[10]；（b）MiniScope V3 的分解图; （c）戴着微型显微镜的小鼠示意图[14]；（d）小鼠大脑中神经元活动的荧光图像[14]Fig.1 A system with a basic imaging function.(a) Cross sectional view of integrated microscope proposed by Ghosh et al; (b)exploded view of the MiniScope V3; (c) a schematic of a mouse wearing a miniature microscope; (d) fluorescent images of neural activity in a mouse brain

2016 年，Cai 等人在Ghosh 等人[9]工作的基础上，设计了一款名为MiniScope V3[10]的微型显微镜，重约3 g，如图1（b）所示。光学系统采用和Ghosh 等人相同的方案，具体数据见表1。Mini-Scope V3 是非常有代表性的微型荧光显微镜，其特点在于所有设计资料全部开源，并提供详细的设计文档、零件采购教程、组装和实验应用指南等，极大地方便了研究人员的使用，目前已经被全世界几百家实验室使用并应用到神经科学的研究中[11]。

2016 年，Barbera 等人设计了一款微型显微镜miniscope[12]，重约2.4 g，图1（c）所示为戴着微型显微镜的小鼠示意图。在光学系统部分，物镜仅使用了一片直径为4 mm 的非球面透镜，并与中继GRIN 透镜结合来对小鼠的深脑区成像，CMOS 图像传感器拍摄到的小鼠大脑中神经活动的图片如图1（d）所示。miniscope 的特点在于获得同等单细胞分辨率的情况下视场比上述系统大1 倍，光学系统具体数据见表1。2018 年，他们详细介绍了miniscope 的设计和组装过程、GRIN透镜植入小鼠脑中的手术过程、微型显微镜安装在小鼠头部的过程以及数据的采集和分析方法[13-14]。

2018 年， Jacob 等人设计并开源了一款微型显微镜CHEndoscope[15]，重约4.5g。光学系统采用和Ghosh 等人相同的方案，具体数据见表1。其特点在于：使用了3D 打印的显微镜外壳和集成相机模块，方便显微镜的组装与调试，非常适合喜欢使用现成组件的研究人员。

2020 年，Bagramyan 等人设计了一款重量仅为1.3 g 的微型显微镜[16]，是目前正式见刊的重量最轻的系统。物镜由直径仅为0.5 mm 的GRIN透镜和中继GRIN 透镜组成；管镜为一片平凸透镜。这款显微镜的优点在于重量轻，且使用小直径的GRIN 透镜在植入动物大脑时对组织的损伤更小，缺点在于成像视场很小（仅为105 μm），明显低于现有的其他系统，光学性能数据见表1。

2.2 具有无线功能的微型荧光显微镜

2017 年，Liberti 等人设计并开源了一款无线微型显微镜FinchScope[17-19]，重约1.8 g，如图2（a）所示。其特点是无线功能可选，选择无线功能仅需要增加一块重约0.6 g 的无线发射机和锂聚合物电池。成像光路设计基于 Ghosh 等人先前描述的光路，具体数据见表2。FinchScope 是一款专门用于监测斑马雀在唱求偶歌时神经活动的系统[20]，可以在进行神经成像时同步记录声音。

表2 具有无线功能的微型荧光显微镜的光学系统和光学性能参数Tab.2 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with wireless function

图2 具有无线功能的系统。（a）FinchScope 的横截面图[19]；（b）无线miniscope 的内部光学元件布局图[22]Fig.2 A system with wiress function.(a) Cross sectional view of FinchScope; (b) internal optics element layout of wireless miniscope

2019 年，Shuman 等人设计并开源了一款无线微型显微镜Wire-free MiniScope[21]，重量为4～5 g。显微镜设计基于MiniScope V3[10]，二者的光学系统完全相同，具体数据见表2。但为了实现无线记录，对电路部分进行了重新设计，更换了一个重量更轻、功耗更低的CMOS 图像传感器，并加入了SD 卡（Secure Digital Memory Card）存储CMOS 图像传感器输出的数据。

2019 年，Barbera 等人在他们先前设计的有线版本基础上[12]为系统加入了无线功能[22]，重约3.9 g，如图2（b）所示。无线miniscope 与之前的有线版本相比，光学系统完全相同，具体数据见表2。为了实现无线记录，无线miniscope 中加入了SD 卡用以记录CMOS 图像传感器输出的数据，并使用电池背包为系统供电。通过这些改进解除了电线对动物行为的影响，可以同时对多个动物进行记录，研究动物在群居条件下的更复杂行为。

2023 年，Wang 等人设计了一款具有无线图像传输功能的微型显微镜wScope[23]，重2.7 g。光学系统设计基于MiniScope V3，具体数据见表2。wScope 与之前报道的使用SD 卡实现无线记录的系统相比有巨大优势，不仅可以在记录的过程中实时查看和记录图像，而且还能在实验过程中修改显微镜的参数。

2.3 具有三维成像功能的微型荧光显微镜

2018 年，Skocek 等人设计了一款具有三维成像功能的微型显微镜MiniLFM[24]，重量为4.7g，如图3（a）所示。光学系统设计基于MiniScope V3，具体数据见表3。为了实现三维成像，他们在原本的像平面处放置了一个微透镜阵列（Microlens Array，MLA），将头戴式显微镜技术与光场显微镜[25]（Light Field Microscope，LFM）技术和约 束 矩 阵 分 解 技 术（Seeded Iterative Demixing，SID）[26]结合使用，从而使二维图像传感器在单次曝光中能捕获到三维体积信息。

表3 具有三维成像功能的微型荧光显微镜的光学系统和光学性能参数Tab.3 Optical system and optical performance parameters of the miniature fluorescence microscope with 3D imaging functionality

图3 具有三维成像功能的系统。（a）MiniLFM 的横截面图[24]；（b）Miniscope3D 的横截面图[27];（c）Bagramyan 等人的显微镜横截面图[28]；（d）SIMscope3D 的横截面图[29]Fig.3 A system with 3D imaging functionality.(a) Cross sectional view of MiniLFM; (b) cross sectional view of Miniscope3D;(c) microscope cross section by Bagramyan et al; (d) cross sectional view of SIMscope3D

2020 年，Yanny 等人设计了一款具有三维成像功能的微型显微镜Miniscope3D[27]，重约2.5g。显微镜设计基于MiniScope V3，具体数据见表3。为了实现三维成像，在物镜光阑处放置了一个相位掩模板，可以将三维样本中的每个点在传感器上生成独特的高频模式，从而可以在单次二维成像中编码体积信息，如图3（b）所示。相比于MiniLFM[24]，Miniscope3D 使用了新的硬件方案和图像重建算法，在更大的成像视场上实现了高一倍的分辨率。

2021 年，Bagramyan 等人在他们先前报道的系统基础上[16]，又设计了一款具有三维成像功能的系统[28]，重量仅为1.4g，如图3（c）所示。光学系统与先前的设计基本相同，具体数据见表3。为了实现三维成像，他们在物镜后面放置了一片可调谐液晶透镜（Tunable Liquid Crystal Lens，TLCL）进行轴向扫描成像。TLCL 是由他们自己设计定制的，重量仅为0.1g，直径仅为0.5mm，可实现98μm 的深度调节。

2022 年，Supekar 等人设计了一款使用结构光照明的具有三维成像功能的微型显微镜SIMscope3D[29]，重6.7g，如图3（d）所示。为了实现高分辨率三维成像，他们首次将结构光照明引入到了微型显微镜的设计中，消除了离焦荧光和散射光对成像的影响，然后结合电湿润透镜（Electrowetting Lens，EWL）进行轴向扫描来实现三维成像。但是结构光照明的范围比较小，导致系统成像视场比较小（仅为207 μm），明显低于现有的其他系统，具体数据见表3。

2.4 具有双区域成像功能的微型荧光显微镜

2019 年，Gonzalez 等人设计了一款能够对小鼠大脑进行双区域成像的微型显微镜[30]。光学系统设计基于Ghosh[9]等人的工作，具体数据见表4。外壳部分设计基于MiniScope V3[10]，电路部分设计基于FinchScope[17-19]，但是他们进行了优化设计，最终使显微镜的重量足够轻且体积足够小，可以在一只小鼠头上同时安装两个进行双区域成像。

表4 具有双区域成像功能的微型荧光显微镜的光学系统和光学性能参数Tab.4 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with dual region imaging functionality

2020 年，de Groot 等人设计开源了一款微型显微镜NINscope[31]，重1.6 g，如图4（a）所示。光学性能数据见表4。与其他系统相比，NINscope重量轻、体积小，允许在一只小鼠的头上安装两个，对不同大脑区域同时进行成像，如图4（b）所示。

图4 具有双区域成像功能的系统。（a） NINscope 的主体和内部光学元件布局图[31]；（b）一只安装了两个NINscope 的小鼠[31]Fig.4 A system with dual region imaging functionality.(a)NINscope body and internal optics element layout;(b) a mouse with two NINscopes mounted

2.5 具有双色成像功能的微型荧光显微镜

2020 年，加州大学洛杉矶分校发布了新一代开源的微型显微镜MiniScope V4[32-33]，重量仅为2.6 g，如图5（a）所示。光学系统的物镜模块使用了两片消色差双胶合透镜，管镜使用了一片消色差双胶合透镜，消除了色差引起的焦点偏移，可以进行双色荧光成像[34]，具体数据见表5。与上一代MiniScope V3[10]相比，重量更轻、视场更大，还加入了电湿润透镜，可以实现200 μm 焦距的电动调节。

表5 具有双色成像功能的微型荧光显微镜的光学系统和光学性能参数Tab.5 Optical system and optical performance parameters of a miniature fluorescence microscope with two-color imaging functionality

图5 具有双色成像功能的系统。（a）MiniScope V4 的横截 面 图；（b）DCFIMM-SBI 的 横 截 面 图[35]；（c）DCFIMM-DBI 的横截面图[35]Fig.5 A system with two-color imaging functionality.(a)Cross sectional view of MiniScope V4; (b) cross sectional view of DCFIMM-SBI; (c) cross sectional view of DCFIMM-DBI

2022 年，蓝凯秋等人设计了一款具有双色成像功能的微型显微镜[35]，重量为6.2 g。为了实现双色成像，必须要校正色散引起的焦移，因此在光学系统设计上采用了全消色差光学元件。同时，为了对不同的大脑区域进行成像，分别设计了如图5（b）所示的用于大脑表层成像的光学系统DCFIMM-SBI（Superficial Brain Imaging，SBI），和如图5（c）所示的用于大脑深层成像的光学系统DCFIMM-DBI（Deep Brain Imaging，DBI），具体数据见表5。

2.6 小 结

本节对目前报道的小视场微型单光子荧光显微镜进行了详细介绍，现将其光学系统和光学性能归纳到下表6。

表6 小视场微型单光子荧光显微镜的光学系统组成和光学性能参数Tab.6 Optical system composition and optical performance parameters of miniature single photon fluorescence microscope with a small field

从表6 可以看到，小视场微型单光子荧光显微镜的光学系统设计方案基本统一。

对于物镜基本都使用GRIN 透镜，使用GRIN透镜作为物镜的优势如下：

（1）GRIN 透镜具有比球面透镜更轻的质量和更高的光学性能，仅用一片GRIN 透镜就能在较高的数值孔径（NA=0.5）下获得很好的成像质量。

（2）圆柱状的GRIN 透镜外形小巧，底部平坦，可以在较小损伤的条件下植入实验动物的大脑，更有利于实验动物的健康。

使用GRIN 透镜作为物镜的主要缺点为：

（1）GRIN 透镜无法校正色差，只能应用在单色荧光成像系统中。对于双色荧光成像系统，需要使用消色差光学透镜组进行系统设计[35]。

（2）GRIN 透镜的成像视场比较小，只能对光轴附近的光线良好成像。对轴外物点成像时像差很大且难以校正，所以用GRIN 透镜作为物镜的系统视场通常小于1 mm。

当视场需求进一步增加时，有些系统使用了非球透镜作为物镜，但是仍需要与GRIN 透镜结合使用。当需要双色成像时，双胶合透镜得到应用。

对于管镜，基本都使用消色差双胶合透镜，消除了色差对成像质量的影响。但是也有几个对重量控制比较严格的系统，没有校正色差，仅使用一片平凸透镜。

3 大视场微型单光子荧光显微镜

大视场微型单光子荧光显微镜（FOV>7mm）可以对小鼠的整个大脑皮层的神经活动进行观测，能进一步了解各脑区间的相互作用关系，这对“打破神经密码”，即破译神经系统编码、存储、处理信息的方式有很大的帮助。但要想实现大视场，需要复杂的光学设计和光学装调技术，目前研究的还很少，只有少数的几篇文章报道了他们的设计，下面将分别进行介绍。

3.1 现有的大视场系统

2018 年，Scott 等人设计开源了一款微型显微镜cScope[36]，重量为33 g。光学系统布局如图6（a）所示，光学性能数据见表7。cScope 提供了超大的视场，可以同时对实验动物多个大脑区域进行观测，但是由于光学系统使用了现成的商用透镜，导致系统设计比较复杂，整体重量比较大。

表7 大视场微型荧光显微镜的光学系统和光学性能参数Tab.7 Optical system and optical performance parameters of a large field miniature fluorescence microscope

图6 现有的大视场系统。（a）cScope 的成像路径光路图[36]；（b）CM2 的成像路径光路图[37]；（c）完全组装的mScope[46]Fig.6 Existing large filed of view system.(a) Imaging optical path of cScope; (b) imaging optical path of CM2; (c) fully assembled mScope

2020 年，Xue 等人[37]利用计算成像技术设计了一款微型显微镜CM2，重19 g。光学系统如图6（b）所示，仅使用一片微透镜阵列（MLA）作为成像元件，摆脱了传统微型显微镜的物镜或GRIN透镜对视场的限制，具体数据见表7。CM2成像方法结合了集成成像[38-39]、光场显微镜[40-42]、复眼成像[43]、阵列显微镜[44]和孔径编码成像[45]的思想。其工作原理是首先使用MLA 收集单个二维测量值，然后基于点扩散函数（PSF）计算重建图像。

2021 年，Rynes 等人设计了一款具有超大视场的微型显微镜mScope[46]，如图6（c）所示，重量仅为3.8g。mScope 的光学系统极为简单，仅使用一片双凸透镜进行成像，具体数据见表7。mScope以很轻的重量实现了超大的视场，但是牺牲了系统的分辨率，最终系统分辨率只有几十微米。

3.2 小 结

本节对目前报道的大视场系统进行了详细介绍，从中可以看到，目前对大视场微型单光子荧光显微镜的研究还很少，技术还不是很成熟。成像质量相对较差，无法分辨单个神经元，且系统的重量比较大，对动物的自由活动造成了一定的限制。虽然计算成像技术可以在获得较高分辨率的同时保持比较轻的重量，但是计算成像对于活体动物体内这种密集、低对比度的场景进行图像重建难度很大，事实上目前还没实验证明这种技术在活体动物体内有效。所以目前大视场微型单光子荧光显微镜的研究还处于起始阶段，在未来还有很大的发展空间。

4 总结与展望

本文对目前报道的微型单光子荧光显微镜的光学系统和光学性能进行了详细介绍，可以看到，Ghosh 等人[9]做出的开创性工作为微型单光子荧光显微镜的发展奠定了重要基础，后面有许多研究人员都根据Ghosh 等人的工作，做出了自己的设计。最为著名的是MiniScope V3[10]，因为Mini-Scope V3 是开源的，提供了详细的设计文件和参考指南。除此之外还有miniscope[12-14]、CHEndoscope[15]和Finchscope[17-19]等开源项目，它们的出现为微型单光子荧光显微镜的发展起到了巨大的推动作用。不仅成像视场从几百微米发展到几毫米，而且还加入了如无线记录、三维成像、双区域成像和双色成像等功能。然而，面向未来的发展与应用，微型单光子显微镜还有需要改进的地方，下面介绍几个发展方向：

（1）大视场高分辨率成像。以单细胞分辨率对半脑区或全脑区进行高分辨率成像有助于进一步了解大脑产生行为或心理状态的原因。但是由于视场的增加，离轴像差对像质影响严重。光学系统采用简单的双胶合和单片非球面透镜已不能很好地校正像差，需要增加元件的数量和非球面的数量。但此时又会导致体积和重量的增加。为解决上述情况，类似手机镜头里的塑料镜片方案提供了可行性。

（2）基于超构透镜的超轻微型荧光显微镜。超构透镜（Metalens）是一种二维平面透镜结构，是由超构表面（具有亚波长厚度的平面二维超材料）制成的光学元件，利用纳米结构对入射光进行聚焦成像。与传统光学透镜相比，超构透镜拥有体积更小、重量更轻、成本更低、成像更好、更易集成等优点，为紧凑集成的光学系统提供了潜在的解决方案。将超构透镜应用到荧光显微镜上，可以在NA 更大的条件下实现较大视场成像，物镜仅为1 片，整机重量有望更轻。