植被类型对露天矿复垦土壤微生物固碳潜力及路径的影响

尤云楠,朱燕峰,陈 浮,①,程彦郡,董文雪,马 静

(1.中国矿业大学矿山生态修复教育部工程研究中心,江苏 徐州 221116;2.河海大学公共管理学院,江苏 南京 210098;3.中国矿业大学化工学院,江苏 徐州 221116)

露天采矿是人类破坏地表生态系统最剧烈的活动,严重改变地表形态,损毁植被和景观,恶化土壤环境,对土壤微生物生存产生极不利的影响[1-2]。采矿扰动破坏了黄土高原脆弱生态环境,加剧了水土流失和植被退化,改变了地球生物化学和碳循环过程,降低了植被-土壤碳汇功能,增加了全球气候风险[3-4]。黄土高原是全球最重要的煤炭产区,长期开采形成的采煤迹地面积约450万hm2,已成为国土空间生态修复的重中之重[5]。但如此大规模的修复如果纯粹依靠工程修复,人力物力投入过巨,基于自然的解决方案是必由之路。充分调控植被、土壤和微生物间互作机制,激发退化生态系统的恢复力,不仅可促进脆弱矿区生态环境的恢复,还能够发挥复垦场地巨大的固碳潜力,对恢复黄土高原生态和缓解气候变化具有重要意义。

土壤是最大的陆地碳库,土地利用变化改变了土壤碳积累率和周转率、土壤侵蚀以及植被生物量,对全球碳循环产生重大影响[6-8]。健康的土壤具有稳定的生态功能,可以减少碳排放,有效地缓解气候变化[9]。然而,露天矿山植被几乎被完全破坏,改变了生物地球化学循环,干扰了植被、土壤和微生物之间互作机制,降低了土壤环境稳定性。植被恢复是矿山生态健康的标志,不仅改善矿区自然景观,还可以促进土壤及微生物功能发育,增加碳固持能力。植被固碳作用虽广为人知,但对微生物固碳的理解仍很不充分[10-11],目前已知的微生物固碳途径主要有卡尔文循环、还原三羧酸循环和3-羟基丙酸双循环等6种[12]。以往土壤碳固持研究多集中于农田、森林和草原等单一生态系统[13-15]。例如,草地土壤的高碳储存率与地上、地下生物量以及物种丰富度有密切关系[16];不同植被的凋落物和根际环境影响酶的分泌,从而导致土壤微生物多样性和生理生化过程的差异[11];多样化的植被类型尤其是豆科植物可以大大提高退化和废弃农田的碳固持能力。但对高强度人为扰动引发的受损矿山生态系统关注极少[17],植被恢复及不同组合如何影响微生物群落变化?微生物固碳的潜力、差异和作用机制是什么?这些问题限制着“基于自然的解决方案”理念在受损矿山生态修复的大规模推广和全面应用。

近20年黄土高原矿区生态恢复倍受重视,但受立地条件限制,一些矿山生态恢复效果差,究其根源主要是缺少植被和土壤的协同恢复。当前工程修复过分强调景观效应,经常引种一些高大非本土的景观树种,植被生长对水分、养分的需求大大超过复垦土壤及微生物的自维持能力。因此,厘清不同植被组合对土壤细菌群落结构与功能的影响,挖掘固碳潜力及其路径,对“基于自然的解决方案”的黄土高原矿区生态修复显得尤为重要。为此,选择黑岱沟露天矿北排土场复垦区为研究对象,利用高通量测序技术和实时荧光定量PCR技术检测复垦土壤细菌群落及固碳功能基因丰度[18],探究油松(YS)、油松+杨树(DYS)和油松+杨树+苜蓿(DYX)等不同植被类型对土壤理化性质、细菌群落及固碳功能基因的影响,为“基于自然的解决方案”的黄土高原受损矿山生态修复提供科学支撑。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

选择内蒙古准格尔旗黑岱沟露天矿北排土场为研究区,地理坐标为39°43′ N～39°49′ N、111°10′ E～111°25′ E。该区域属于典型温带半干旱大陆性气候区,年均气温为6.2～7.2 ℃,年均降水量为391.6 mm,多集中于7—9月,年蒸发量为1 824.9～2 896.1 mm。该排土场为典型黄土丘陵沟壑区,占地面积为512.0 hm2,平均海拔为1 260.0 m。其中,北排土场于1992年开始复垦,占地面积为210.0 hm2,按平台-边坡相间形式分3层21个种植区,每层高度差为30.0 m,下层海拔为1 215.0 m。主要种植有油松、刺槐、杨树、丁香、伏地柏、杨树+伏地柏、油松+杨树、油松+杨树+紫花苜蓿、柠条、沙棘、杨树+沙棘、山杏、油松+山杏、紫花苜蓿+长茅草等多种植物或组合。

1.2 样品采集与分析

2020年7月28日—8月4日对北排土场复垦区展开野外调查,采集单一油松(针叶林,YS)、油松+杨树(混交林,DYS)、油松+杨树+紫花苜蓿(复合林,DYX)3类典型植被组合区域土样。18个调查样方面积为10 m×10 m,先铲除土壤表层凋落物,在每个样方内随机选择5个样点采集0～10 cm表土各约200 g,混合为1 000 g复合样,共18个复合样(图1)。采集后先过2 mm孔径筛网去除砾石和动植物残体,将土样分成3份装入无菌袋密封,利用-20 ℃车载冰箱带回实验室,其中,一份新鲜土样贮存于-80 ℃ 冰箱用于微生物信息测试;一份在室内自然风干后用于土壤理化性质分析;另一份贮存于4 ℃冰箱用于土壤理化性质和酶活性测试。pH值采用电位法〔m(水)∶V(土)=2.5∶1〕测定(PHC-3C,上海雷磁);土壤体积含水率(WC)采用一体检测仪测定(TR-8D,北京顺科达);有机碳(SOC)含量采用重铬酸钾水合氧化法[19]测定;易氧化有机碳(EOOC)含量采用高锰酸钾氧化法测定;全氮(TN)含量采用半微量凯氏定氮法测定;铵态氮(AN)和硝态氮(NN)含量采用氯化钙浸提-紫外分光光度法[20]测定;有效磷(AP)含量釆用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法[20]测定。

图1 研究区及采样点位置

1.3 固碳功能基因定量检测与高通量测序

土壤总DNA通过E.Z.N.A.®试剂盒(Omega Bio-tek,USA)提取,采用超微量分光光度计(NanoDrop2000)经w=1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和纯度。采用16S rDNA的V3～V4区标准引物对338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增,95 ℃预变性3 min,95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,27个循环,最后72 ℃延伸10 min。通过AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化,Tris-HCl 洗脱,w=2%琼脂糖电泳检测后回收PCR产物,再通过QuantiFluorTM-ST定量检测。采用Illumina MiSeq(Illumina,美国)标准方法利用纯化后的扩增片段构建测序文库,再采用美吉Miseq PE300平台测序。测序工作委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。原始测序序列采用Trimmomatic软件质控,使用FLASH软件进行拼接,数据质控拼接获得的优化序列中可能还会存在一些PCR扩增错误和测序错误,通过序列降噪方法DADA2对优化数据进行进一步处理,去除优化数据中存在的PCR扩增错误或测序错误,以获得样本中扩增子序列变体(ASV),基于ASV代表序列信息和丰度信息,采用RDP classifier贝叶斯算法对ASV代表序列进行分类学分析,获得ASV在域、界、门、纲、目、科、属、种分类水平的注释信息。细菌16S rRNA原始序列数据已保存于NCBI数据库中,登记号为PRJNA725677。

碳固定功能基因采用高通量功能基因芯片(quantitative microbial element cycling,QMEC)进行定量检测(广东美格基因科技有限公司,深圳)[21]。根据MagaBio试剂盒方法提取0.25 g样品土壤中的DNA,采用Qubit 4.0荧光仪(Thermo Fisher Scientific,USA)检测其纯度及总量后,稀释DNA至20 ng·μL-1,将样品板和引物板试剂分别加到qPCR仪(Takara Biomedical Technology,上海)微孔中扩增。所有引物组的qPCR反应设3次重复,1个对照。在95 ℃初始酶活化5 min,再进行40个循环(95 ℃变性0.5 min,58 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸0.5 min)。采用Smart Chip实时PCR系统执行qPCR反应及荧光信号检测,自动生成扩增和溶解曲线。采用Canco 5.0计算得到基因检出值和扩增循环数,以16S rRNA为参照系进行标准化,得到土壤基因相对定量数据,与Roche荧光定量PCR仪检测的参照系绝对定量信息进行比较,得到碳固定基因的绝对定量丰度[21]。

1.4 数据统计与分析

不同处理组土壤理化性质、酶活性和碳固定功能基因采用ANOVA分析检验差异显著性,采用最小显著极差法(LSD)进行均值多重比较,采用Kruskal-WallisH法检验细菌群落属水平相对丰度差异显著性。采用冗余分析(RDA)揭示微生物群落与环境因子之间的关系,采用Pearson相关性分析碳固定功能基因丰度与环境因子之间的关系,分析计算在Majorbio云平台(www.majorbio.com)上完成。采用R 4.3.0绘制土壤理化性质、酶活性和功能基因丰度等柱状图及与环境因子之间的相关性热图,采用Amos 28.0拟合结构方程模型(SEM)表示土壤理化性质、酶活性和细菌菌门与功能基因丰度之间的关系。对碳固定功能基因丰度进行归一化处理[22],计算公式为

(1)

式(1)中,xi为第i样本单个基因丰度;I和N分别为样本和基因数目;x′为碳固定微生物功能类群的归一化丰度。

2 结果与分析

2.1 不同处理组复垦土壤理化性质的变化

如图2所示,植被类型对土壤理化性质影响显著。不同处理组WC随植被种类增加呈下降趋势,DYX处理比DYS和YS处理分别下降40%和80%,YS处理与DYS和DYX处理之间呈极显著差异(P<0.01)。pH值变化趋势与WC相似,但下降幅度稍小,DYX处理与YS和DYS处理之间呈显著差异(P<0.05)。

YS为油松,DYS为油松+杨树,DYX为油松+杨树+苜蓿。箱体上、中和下线分别表示上四分位数、中位数和下四分位数。

不同处理组SOC含量随植被种类增加呈上升趋势,DYX处理SOC平均含量达10.8 g·kg-1,比YS处理增加158.0%,3个处理间呈显著差异(P<0.05)。TN和NN含量变化趋势相似,均随植被种类增加呈上升趋势,DYX处理TN和NN含量均值最高,而YS处理TN含量极显著低于DYS和DYX处理(P<0.01),DYX处理NN含量极显著高于YS和DYS处理(P<0.01)。3个处理AN含量无显著差异。EOOC含量随植被种类增加呈下降趋势,DYX处理与YS和DYS处理EOOC含量之间呈显著差异(P<0.05)。AP含量变化趋势与SOC含量几乎一致,但仅在YS处理与DYX处理之间呈显著差异(P<0.05)。

2.2 不同处理组复垦土壤细菌群落组成和固碳基因丰度变化

如图3所示,不同植被组合对土壤细菌群落组成有一定影响,但并不显著。3个处理中相对丰度排名前9的菌门总相对丰度占95%以上,优势菌门(相对丰度>1%)中的前4位无显著差异〔图3(a)〕。放线菌门(Actinobacteriota)相对丰度最高,YS、DYS和DYX处理分别为38.03%、36.80%和34.20%。变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度依次减少。优势菌门中芽单胞菌门(Gemmatimonadota)、粘球菌门(Myxococcota)和髌骨细菌门(Patescibacteria)相对丰度在不同处理组之间呈显著差异(P<0.05)。不同处理组酸杆菌门中酸杆菌属(RB41)和变形菌门中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)相对丰度呈显著差异(P<0.05)。DYX处理RB41相对丰度明显高于其他处理,不同处理组Sphingomonas相对丰度随植被种类增加显著降低(P<0.01)〔图3(b)〕。

YS为油松,DYS为油松+杨树,DYX为油松+杨树+苜蓿。

如图4所示,随植被种类增加,不同处理固碳功能基因丰度呈显著上升趋势。其中,rbcL、korA、acsA和acsE基因丰度显著升高(P<0.05),YS和DYS处理rbcL和korA基因丰度与DYX处理之间存在显著差异(P<0.001),DYX处理rbcL基因丰度比YS和DYX处理分别增加19.1%和26.2%,DYX处理korA基因丰度比YS和DYS处理均增加约15.0%。不同处理组acsA和acsE基因丰度呈极显著差异(P<0.001)。其他路径中pccA、smt和frda基因丰度随植被种类增加呈上升趋势,YS、DYS处理与DYX处理之间均呈极显著差异(P<0.001)。

2.3 土壤碳固定功能基因与环境因子间相关关系

RDA分析〔图5(a)〕显示不同处理组细菌群落结构与环境因子之间的关系,不同处理组之间形成了明显聚类且各聚类相互分离,表明环境因子对群落结构变异的解释较好。从箭头长度〔图5(a)〕可知,WC、SOC、TN和NN是驱动群落结构变化的主导因子(P<0.01),其中,WC与SOC、TN和NN对群落结构的作用相反。相关性热图分析〔图5(b)〕表明,固碳功能基因丰度与SOC、TN、NN和AP呈正相关关系,与WC、pH、EOOC和AN呈负相关关系。其中,rbcL、korA、acsA、acsE、fraA和smtA基因丰度与NN和SOC均呈显著正相关(P<0.05),与pH和WC均呈显著负相关(P<0.05),差异十分明显。rbcL、acsA、acsE和smtA基因丰度与TN和AP均呈正相关关系且部分显著(P<0.05),aclB、acsB、accA和cdaR基因与环境因子之间相关性不高,但rbcL、korA、acsA、acsE、fraA和smtA基因与环境因子之间相关性较强。相对丰度排名靠前的菌门中仅放线菌门与WC呈显著正相关(P<0.05),而排名靠后的粘球菌门和髌骨菌门却与环境因子之间呈显著相关(P<0.05)。粘球菌门与SOC、TN、NN和AP均呈显著正相关(P<0.05),与WC、pH和EOOC均呈显著负相关(P<0.05),髌骨菌门则相反。

YS为油松,DYS为油松+杨树,DYX为油松+杨树+苜蓿。WC为土壤含水率,SOC为有机碳,TN为全氮,AN为铵态氮,NN为硝态氮,AP为有效磷,EOOC为易氧化有机碳。

结构方程模型拟合结果表明,与纯油松林(YS)〔图6(a)〕相比,混交林(DYS)中植被种类增加将直接影响TN含量,再间接影响芽单胞菌门相对丰度,从而操控固碳功能基因丰度〔图6(b)〕。复合林(DYX)中植被种类增加将直接影响SOC含量,再间接影响粘球菌门相对丰度,从而操控固碳功能基因丰度〔图6(c)〕。综合图6结果,植被种类增加将直接正向影响TN和SOC含量,并负向影响WC(P<0.001),TN含量再间接影响芽单胞菌门和粘球菌门相对丰度,SOC含量再负向影响芽单胞菌门相对丰度,WC再负向影响粘球菌门相对丰度,从而操控土壤固碳功能基因丰度。最终形成一个完整的4层递进结构关系,显示不同处理组固碳路径的变化,同时也表明微生物固碳潜力受群落组成的影响远高于环境因子。

YS为油松,DYS为油松+杨树,DYX为油松+杨树+苜蓿。WC为土壤含水率,SOC为有机碳,TN为全氮。χ2为卡方检验值,GFI为拟合优度指数,AIC为赤池信息量,RMSEA为近似误差均方根。箭头上数值为标准通径系数,箭头粗细表示相关性高低,粗实线和粗虚线分别表示正相关和负相关,细实线和细虚线表示无显著差异,R2表示通径解释度。*、**和***分别表示各路径显著性水平为P<0.05、P<0.01和P<0.001。

3 讨论

3.1 不同植被类型对土壤理化性质的影响

研究区为典型半干旱区,年均降水量少,不同植被组合加剧了植物对土壤水分的竞争,可能是由于植物不同根际深度、叶面积和覆盖度的差异影响植物对土壤水分的获取[23-24]。研究[25]表明,半干旱地区油松纯林地的植物水分亏缺度比杨树的水分亏缺度要小,油松根际保水能力较强。此外,杨树叶面积比油松大,增加了水分蒸腾,继而影响土壤含水率,因此,笔者研究中WC随植被种类增加呈显著下降趋势。露天采矿严重破坏土壤环境,导致土壤养分和pH值下降。先前研究[26]已证实植被恢复可显著提高土壤pH值。笔者研究区未复垦裸地pH为7.8[27],不同植被处理组pH值均高于未复垦裸地,且随植被种类增加而显著下降(P<0.05)。这主要是由于随植被种类增加,凋落物种类和数量也增加,丰富的有机酸和CO2矿化反应降低了土壤pH值。此外,实地采样过程中也发现,油松林腐殖质层较厚。腐殖质中—COOH等酸性基团可以提供大量阳离子交换点[28],对减少土壤酸化有缓冲能力。多样化植被组合显著提高土壤SOC含量(P<0.05),各处理由高到低为DYX>DYS>YS。有机碳主要依赖植物源和微生物源的碳储存,油松含脂凋落物很难分解,但多种植被引入不仅提高了凋落物数量,亦增加了易降解凋落物种类,因此DYX处理SOC含量呈现高水平[29]。另外,植被种类增加可能促进根际分泌更多的糖、氨基酸和其他低相对分子质量有机化合物[30],促进微生物生长和营养循环,继而增加土壤SOC的积累。同时,苜蓿作为豆科植物,能有效够固定大气中氮,这解释了DYX处理NN含量最高、YS处理AN含量最低这一结果,并且该现象与油松凋落物不易分解密切相关[31]。从笔者研究结果来看,多样化植被组合对矿区复垦土壤发育至关重要,更加复杂的根际环境为微生物提供了更适宜的生长环境,从而促进物质循环和养分转化[32]。

3.2 不同植被类型对固碳微生物类群与功能基因的影响

先前研究已证实不同植被类型会改变土壤微生物群落结构和功能[33],但微生物群落受土壤属性、植被类型和土地利用历史等复杂因素的影响[26,34]。不同植被处理最优势菌门为放线菌门、变形菌门、酸杆菌门和绿弯菌门,这与黑岱沟矿区相关研究结果[35]相一致。许多固碳微生物类群分属于放线菌门、变形菌门和酸杆菌门[36],放线菌门适应于弱碱性土壤中生存[37],且更倾向于寡营养环境[38]。变形菌门环境适应能力强[39],在矿山等恶劣复杂环境中更易生存。酸杆菌门多属嗜酸菌[40],植物恢复后pH下降的环境更有利于其生长。酸杆菌和鞘氨醇单胞菌分属于酸杆菌门和变形菌门,为固碳微生物类群丰富的菌门[36]。鞘氨醇单胞菌是一类高效多环芳烃降解菌[41],多样化植被凋落物和根际环境促进了土壤中有机污染物降解,导致以有机污染物为营养物的鞘氨醇单胞菌丰度持续下降。尽管一些高固碳微生物类群相对丰度发生了变化,但群落组成变化并不显著,主要原因是土壤利用史对群落的影响远高于植被和土壤属性[42],细菌群落演替进程更为缓慢和重叠[43],完全恢复并呈差异显著的年限十分久远[44]。

土壤微生物驱动着养分循环,固碳功能基因丰度反映了固碳潜力的大小[45]。笔者研究共测定11类固碳功能基因,其中7类基因(rbcL、korA、acsA、acsE、pccA、smt和frda基因)显著增加(P<0.05)(图4),以DYX处理丰度为最高。黄倩[46]发现,草地固碳速率比乔木、灌木林更高。笔者研究中DYX处理(含有紫花苜蓿)固碳基因丰度最高的结果与之相似。笔者研究发现SOC含量与多个固碳基因丰度呈显著正相关关系〔图5(b)〕,表明SOC含量变化可能驱动着固碳基因丰度的变化。YUAN等[47]研究发现,参与卡尔文循环的rbcL基因丰度与SOC含量密切相关。SOC含量是编码rbcL基因的功能微生物类群的显著影响因子[48],同时TN含量也影响rbcL基因丰度[49]。

3.3 不同植被类型对土壤微生物固碳路径的影响

笔者研究表明固碳微生物类群至少有6种不同固碳途径(图4),微生物根据可利用底物和能量需求选择适合的固碳途径[50]。笔者研究中参与卡尔文循环的固碳基因丰度占优势地位,LONG等[51]和NOWAK等[52]发现在草地和农田生态系统中参与卡尔文循环的基因丰度占比高;笔者研究中不同处理还原三羧酸循环相关功能基因(korA和aclb)丰度也较高,这与排土场初始状态和立地条件密切相关,黑岱沟露天矿处于黄土风沙区,开采后植被破坏殆尽,类似荒漠。这也证实了LIU等[53]发现还原三羧酸循环是荒漠中微生物固碳的重要途径。从单一针叶林(YS)到混交林(DYS)再到复合林(DYX),植被种类不断丰富,凋落物类型多样,直接改变了土壤环境状况,影响微生物群落生长与代谢,从而调控固碳潜力和途径。结构方程模型拟合预测了不同植被组合对固碳基因丰度的影响及路径,可以看出:(1)相对于YS处理,阔叶树种的引入有效增加凋落物和分解速率,直接改善土壤TN和SOC含量,TN含量再间接影响芽单胞菌门相对丰度,从而使得固碳基因丰度下降〔图6(a)〕。这与其他研究结果[54]极为相似,高氮条件下碳循环功能基因丰度下降,芽单胞菌门与土壤SOC和TN含量密切相关[55],因其分泌的蛋白酶可分解复杂碳水化合物[56],从而促进碳降解;(2)相对于DYS处理,增加紫花苜蓿〔图6(b)〕后,DYX处理直接影响土壤SOC含量,再间接影响粘球菌门相对丰度,从而促进微生物固碳潜力;(3)当考察全部物种时,植被类型改变了土壤TN和SOC含量以及WC,其中,TN含量间接影响芽单胞菌门和粘球菌门相对丰度,从而操控固碳基因丰度。SOC含量间接影响芽单胞菌门相对丰度,WC间接影响粘球菌门相对丰度,分别操控固碳基因丰度(图6c)。不同处理组土壤微生物固碳潜力及路径差异十分显著,固碳潜力受微生物群落组成的影响大于环境因子的影响,植被种类增加丰富了复垦土壤微生物固碳途径。

4 结论

(1)内蒙古准格尔旗黑岱沟露天矿排土场不同植被类型对土壤理化性质影响显著(P<0.05)。植被种类越多,pH值和WC下降越显著,同时土壤SOC、TN和NN含量随之显著增加。

(2)不同植被类型对复垦土壤细菌群落组成影响不显著,仅部分菌门(芽单胞菌门和粘球菌门)和部分属(酸杆菌属和鞘氨醇单胞菌属)相对丰度呈显著差异(P<0.05);但对固碳基因丰度影响显著,11类固碳功能基因中有7类(rbcL、korA、acsA、acsE、pccA、smt和frda)显著增加(P<0.05)。

(3)不同植被类型影响土壤环境因子,其中,TN和SOC含量和WC是主导因子(P<0.01),调控固碳微生物类群和功能基因丰度,从而改变矿山复垦土壤微生物固碳途径。