亚硝酸盐对厌氧氨氧化耦合系统的脱氮效能及微生物群落的影响

梁燚彤，李泽敏，吴宇伦，邱光磊，吴海珍，韦朝海*

1.华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510006；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006

厌氧氨氧化（Anammox）具有节省曝气能耗、无需外加碳源和污泥产量低等优势，被认为是最具有前景的废水脱氮工艺（Wu et al.，2022）。目前，Anammox工艺已开始应用于实际含氨氮废水的研究，如焦化废水、垃圾渗滤液、污泥消化液等（Zhou et al.，2020；Huo et al.，2022），通常以短程硝化（PN）和Anammox的工艺组合（PN-A）出现（陈重军等，2014；Han et al.，2020）。然而，鉴于严格的总氮（TN）排放要求与PN-A工艺的局限性，在处理含氨氮废水时，仍需考虑如下问题：（1）Anammox工艺产生的11.2%的NO3-将限制TN的达标或超低排放（Cao et al.，2021；李泽莹等，2022）；（2）长期稳定的部分硝化作用难以维持（Bao et al.，2017）。由此，PN阶段的NO2-/NO3-的溢出不可避免，部分硝化带来的NO2-的积累过量或不足是客观存在的。因此，面对含氨氮废水，Anammox不仅需要一个前端处理工艺（PN），更需要一个后端处理工艺（短程反硝化），以应对水质演变过程中不同价态含氮化合物的浓度区间比例，最终实现总氮的彻底去除。

短程反硝化（PD）耦合厌氧氨氧化技术是实现含氨氮废水最终氮达标或超低排放的关键技术，包括异养反硝化耦合Anammox工艺（Cao et al.，2021；朱紫旋等，2023），利用有机碳源驱动异养反硝化菌将残余的NO3-还原为NO2-。同样，自养反硝化（AuDen）与Anammox的耦合作用也能实现相同的目的，并且在成本效益、环境友好和工艺性能等方面表现出额外的优势（Di Capua et al.，2019）。然而，无论是异养反硝化还是自养反硝化（AuDen）与Anammox工艺的耦合，都依赖于反硝化菌与厌氧氨氧化菌（AnAOB）之间的协同合作。其中，反硝化菌（以FeS作为电子供体）必须足够高效，能够为AnAOB产生足够的NO2-（公式 (1)），同时又不能过于强大，否则，反硝化菌会进一步将NO2-还原为N2（公式 (2)）。因此，Anammox（公式 (3)）与AuDen之间（公式 (1)和 (2)）的反应过程控制非常重要。

NO2-作为中间代谢物，是影响AnAOB与反硝化菌相互作用（合作/竞争）的关键因素。理想情况下，AnAOB与反硝化菌之间实现短程反硝化-厌氧氨氧化的协同合作能够实现高效脱氮。然而，当AnAOB与反硝化菌共培养时，NO2-作为共同竞争底物，如果反硝化菌生长速率过快，会对AnAOB造成威胁，长期运行，可能导致AnAOB的衰退与消亡（马景德等，2019；Pan et al.，2019）。Ma et al.（2021）通过FeS驱动PD-A工艺在长期（120 d）运行的连续流实验中发现，由于硫自养反硝化菌（SOB）与AnAOB对NO2-的竞争导致系统不稳定和脱氮性能下降，Anammox对TN去除的贡献从95.0%下降至80.0%。类似地，Qin et al.（2019）和Wu et al.（2020）在S2-驱动的PD-A工艺长期运行过程中也能发现了AnAOB的相对丰度下降或AnAOB的脱氮性能下降的现象。Yang et al.（2020）进一步表明，在S2O32-驱动的PD-A工艺运行过程中，当NO2-浓度不足时，AuDen反应是Anammox反应的3.40倍。因此，有必要研究NO2-对耦合系统AnAOB和SOB的相互作用与影响机制，对长期脱氮性能及微生物群落加以分析，可为Anammox耦合系统在含氨氮废水中的稳定高效运行提供调控策略。

本研究利用厌氧生物流化床反应器（AFBR）构建了Anammox与FeS驱动的AuDen耦合体系（FSDADAS）。通过模拟NO2-积累的废水水质，评估不同NO2-浓度积累条件下长期反应器运行脱氮过程的稳定性和效能，分析基质效应与协同效应之间的关系；基于高通量测序的结果，对长期连续流反应器的微生物群落演替、微生物相互作用、水质环境与微生物群落之间的相关性进行了分析，重点考察AnAOB与SOB基于NO2-的变化规律，阐明耦合系统的微生物群落的底物响应。通过以上工作，为厌氧氨氧化耦合技术的工程化应用及其过程调控提供原理参考。

1 材料与方法

1.1 反应装置

实验采用厌氧生物流化床（AFBR），装置结构见图1，反应器由有机玻璃制成，总高52.0 cm，反应区内径50.0 mm，外径90.0 mm，有效容积2.50 L，在反应器底部持续通入氮气，维持流态化与厌氧状态（DO<0.10 mg·L-1）。反应器顶部设置三相分离器，防止污泥流失。合成废水经蠕动泵从反应器底部流入，从顶部溢出并收集出水。反应器外壁设置水浴循环层，温度控制在 (32±1) ℃范围内。

图1 AFBR运行装置Figure 1 Schematic diagram of AFBR

1.2 接种污泥与实验用水

厌氧氨氧化种子污泥为实验室长期驯化培养污泥，其混合液悬浮物（MLSS）和混合液挥发性悬浮物（MLVSS）质量浓度分别为5.30 g·L-1和4.20 g·L-1，30 min内沉淀污泥量（SV30）为29%，污泥体积指数（SVI）为55.70 mL·g-1。在培养阶段，最高氮去除负荷（NRR）为 (0.790±0.100) kg·m-3·d-1。Anammox优势菌属为Candidatuskuenenia，占整个群落的0.28%。自养反硝化种子污泥通过收集广州某污水处理厂厌氧池污泥并驯化培养3个月后，其MLSS和MLVSS质量浓度分别为4.60 g·L-1和3.40 g·L-1。SV30为35.0%，SVI为76.1 mL·g-1。在富集阶段，最高NRR为0.400 kg·m-3·g-1。16S rRNA基因测序结果显示，Proteobacteria为优势门，占群落的44.4%，自养反硝化污泥中的优势属为Thiobacillus，占14.3%，未发现与厌氧氨氧化功能相关的属。厌氧氨氧化污泥与自养反硝化污泥的质量浓度按照MLSS为1:1的比例混合接种，种子污泥均由实验室长期富集培养，自养反硝化电子供体采用硫化亚铁，在缺氧的水相环境下通过共沉淀法合成FeS。接种后的混合污泥MLSS和MLVSS分别为4.95 g·L-1和3.41 g·L-1，污泥体积约占反应器总体积的30.0%。

实验采用合成废水，主要由底物、矿物介质和微量元素组成。以NH4Cl、NaNO2和NaNO3作为氮源，底物质量浓度按需配比。矿物介质包括NaHCO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O，微量元素的主要成分包括FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、CuSO4·5H2O、NaMoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、H3BO3和EDTA（Van De Graaf et al.，1996）。

1.3 运行条件

通过模拟不同亚硝酸盐浓度的水质条件，探究亚硝酸盐对耦合系统的长期影响。根据进水中亚硝酸盐和硝酸盐的含量，试验分为3个阶段：N0反应启动阶段、A1–4硝酸盐不足阶段（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50，ρ(NO2-)=0、50、100、150 mg·L-1）、B1–4硝酸盐充足阶段（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00，ρ(NO2-)=0、50、100、150 mg·L-1），实验进水pH始终保持7.80左右，各阶段的运行时间和实验操作条件如表1所示。

表1 AFBR在不同阶段的操作条件Table 1 Operational conditions of the AFBR at different phases

每天收集一次进水和出水样品，测量pH值以及N、S和Fe的浓度。在每个操作阶段结束时（即第21、35、50、65、80、95、110、125和140天）进行污泥样品的收集，9个污泥样品名称分别标记为N0、A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3和B4。

1.4 测试方法

1.4.1 指标测定与分析

指标检测方法参考相关国家标准方法（国家环境保护总局，2002）。水样通过0.22 μm水系滤膜过滤后分别检测与分析，无机阴离子（NO3--N、NO2--N和SO42--S）使用离子色谱法（ICS-900，美国）、NH4+-N采用钠氏试剂分光光度法、Fe(II)/总Fe采用邻菲罗啉分光光度法、以及MLSS/MLVSS采用重量法，而pH、DO分别通过便携式溶氧仪（JPBJ-608，中国）和pH计（PHBJ-260，中国）进行测量。

1.4.2 微生物分析

如1.2节所提及，在每个阶段结束时收集AFBR完全混合后的污泥样品，用液氮快速冷冻并保存至-80 ℃冰箱中，后委托上海美吉生物医药科技有限公司进行16S rRNA基因测序。采用细菌通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）对16S rRNA基因V4－V5区域进行PCR扩增。

1.5 数理分析与计算方法

厌氧氨氧化和自养反硝化对AFBR中总氮的去除贡献率计算方法参考文献（Ji et al.，2020），见公式(1)和 (2)，分别用CAN和CAD表示。

2 结果与讨论

2.1 亚硝酸盐对耦合系统脱氮效能的影响

2.1.1 亚硝酸盐对耦合系统主反应（氮）的影响

为了研究NO2-对耦合系统的脱氮能力的影响，在长期实验中，通过调节进水物料比，对各种形态氮的去除加以分析。图2为AFBR耦合反应器运行期间氮的质量浓度变化及去除效果。启动阶段（N0，1－21 d），在无积累的NO2-条件（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00）下，出水NH4+-N和NO3--N的浓度不断下降，总氮去除率不断提高，表明反应器内自养反硝化与厌氧氨氧化的同时发生，两者耦合成功。运行10 d后，反应器脱氮效能趋于稳定，出水NO3--N浓度接近0，然而，总氮去除负荷（TNRR）水平较低（0.050kg·m-3·d-1），出水NH4+-N质量浓度处在 (23.8±2.0)mg·L-1范围内，出水TN质量浓度较高，超出废水排放达标值（20 mg·L-1）；Anammox对总氮贡献率从80.5%下降至68.0%。估计是由启动阶段耦合反应器内SOB与AnAOB底物NO2-的竞争，两者之间的协同效应较差所导致的（Wu et al.，2020；Ma et al.，2021）。

图2 厌氧流化床反应器（AFBR）的脱氮性能Figure 2 Nitrogen removal performance of anaerobic fluidized bed reactor (AFBR)

在硝酸盐不足的阶段（A，22－80 d），反应器进水ρ(NO3-)/ρ(NH4+)质量浓度不变（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50），积累的NO2-的质量浓度逐渐提高（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）。A1–4阶段出水NO3--N和NO2--N的质量浓度均接近0，剩余氮主要是NH4+-N。当积累的NO2--N质量质量浓度为0、50、100和150 mg·L-1时，A1–4阶段的总氮去除效率分别为48.8%±2.3%、88.1%±3.4%、97.5%±1.4%和98.4%±1.7%，总氮去除负荷分别达到0.100、0.250、0.340和0.420 kg·m-3·d-1。以A1阶段（22－35 d）作为对照组，在NO2-积累的条件（A2–4）下，总氮去除效率和总氮去除负荷显著提高（P<0.05）。值得注意的是，与对照组相比，A2阶段出水NH4+-N质量浓度从(74.3±1.3) mg·L-1大幅下降至 (20.5±2.8) mg·L-1，总氮去除效率从48.8%±2.3%大幅上升至88.1%±3.4%，说明在硝酸盐不足、未满足Anammox底物基质比（1.32）之前，所积累的NO2--N（50 mg·L-1）更倾向于被AnAOB所利用，系统脱氮能力提高可能是由于积累的NO2-能够调节两者之间的协同效应，使耦合系统向有利于脱氮方向发展的缘故。

在硝酸盐充足的阶段（B，81－140 d），反应器进水ρ(NO3-)/ρ(NH4+)质量浓度不变（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00），积累的NO2-质量浓度逐渐提高（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）。B1–4阶段出水NO3--N和NO2--N质量浓度接近于0，剩余氮主要是NH4+-N。当积累的NO2--N质量浓度为0、50、100和150 mg·L-1时，B1–4阶段的总氮去除率分别为80.3%±3.2%、93.6%±3.7%、98.5%±1.1%和97.3%±1.5%，总氮去除负荷分别达到0.230、0.330、0.420和0.480 kg·m-3·d-1。以B1阶段（81－95 d）作为对照组，在有NO2-的条件（B2–4）下，总氮去除率和去除负荷显著提高（P<0.05）。值得注意的是，与对照组相比，B2阶段的出水NH4+-N质量浓度从(36.1±3.3) mg·L-1下降至 (12.1±2.9) mg·L-1，总氮去除率从80.3%±3.2%提高至93.6%±3.7%，表明在基本满足Anammox反应基质比时，积累的NO2--N（50 mg·L-1）亦倾向于被AnAOB所利用，耦合系统的脱氮能力提高。因此，无论在硝酸盐不足（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=0.50）或硝酸盐充足（ρ(NO3-)/ρ(NH4+)=1.00）条件下，随着积累的（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）质量浓度增加，总氮去除率和去除负荷显著提高，所积累的NO2-更倾向于被AnAOB所利用，促进了AnAOB与SOB之间的协同脱氮效应，耦合系统的脱氮能力显著提高。

将B1与A2组（ρ(NOx-)/ρ(NH4+)=1.00，TN=200 mg·L-1）进行对比发现，在NO2-积累条件（A2）下，系统的脱氮率从80.3%±3.2%提高至88.1%±3.4%，Anammox对TN去除的贡献率从81.7%±2.4%提高至92.5%±2.3%，认为是AnAOB与SOB之间对底物NO2-的竞争效应减小，协同效应加强的缘故。对比B2组和A3组，B3组和A4组，结果发现，同样是在NO2-积累的环境中，所积累的NO2-越高，TN去除率提高或保持，SO42-的实际产量相对减少，Anammox对TN去除的贡献率略有下降，说明过量的NO2-积累浓度并不意味着脱氮效率越好，直接影响Anammox的反应，正如文献所报道，大量的研究（Huang et al.，2022；韩雪恪等，2023）证实了过量的NO2–会抑制细菌生长，尤其是AnAOB的生长。NO2–浓度过高将会刺激Anammox松散的细胞外聚合物的快速分泌，导致Anammox颗粒污泥气体释放通道堵塞，进一步导致污泥崩解（Wan et al.，2022）。因此，以相同的TN、NH4+-N含量作为衡量尺度，适量的NO2-积累的环境会使Anammox对TN去除的贡献率及耦合系统的脱氮效率提高，所积累的NO2-能够缓解AnAOB与SOB之间的竞争，加强了协同效应。

2.1.2 亚硝酸盐对耦合系统副产物（硫、铁）的影响

副产物是反应体系冗余能量的体现，能够从侧面反映主反应的脱氮趋势。图3为AFBR耦合反应器运行期间副产物的浓度变化情况。硫酸盐是FeS驱动的自养反硝化（AuDen）脱氮过程的副产物之一，理论上，还原1 mg的NO3--N和NO2--N可分别产生1.27 mg和0.76 mg的SO42--S。AuDen反应的副产物越少，说明耦合系统积累的NO2-越趋向Anammox反应。由图3可知，N0阶（1－21 d），SO42--S产量从30.5 mg·L-1一直增加至41.1 mg·L-1，说明NO2-更趋向于被SOB所利用。A1–4阶段的SO42--S实际产生值依次为 (44.4±1.6)、(52.8±3.2)、(74.6±3.0) 和 (105.0±2.3) mg·L-1，分别是理论值的0.700、0.520、0.540、0.590倍，由此可见，在硝酸盐不足的阶段，在有NO2-积累条件（A2–4）下，AuDen反应的SO42--S产量相对减少，因此，NO2-更倾向于被AnAOB所利用。同理，B1–4阶段的SO42--S实际产生量分别为 (75.2±1.9)、(85.6±1.8)、(114.4±2.7)和 (150.1±4.7) mg·L-1，分别是理论值的0.590、0.520、0.560、0.620倍，由此可见，在硝酸盐充足的阶段，在有NO2–积累的条件（B2–4）下，NO2-也能调节AnAOB与SOB之间的协同作用，减少AuDen反应的SO42-产生量，在一定程度上促进了Anammox反应的发生。值得注意的是，将B1与A2、B2与A3、B3与A4（ρ(NOx-)/ρ(NH4+)=1.00、1.50、2.00，TN=200、250、300 mg·L-1）阶段进行对比发现，相同含量的NOx-，积累的NO2-含量越高（A2–4），AuDen反应的SO42-产量相对减少，正如2.1.1所述，Anammox对TN去除的贡献百分比及耦合系统的脱氮效率显著提高，主要是由于AnAOB与SOB之间对底物NO2-的竞争效应减小、协同效应加强的缘故。

图3 厌氧流化床反应器（AFBR）的硫、铁元素变化Figure 3 Changes of sulfur and iron in anaerobic fluidized bed reactor (AFBR)

铁也是FeS驱动的自养反硝化（AuDen）脱氮过程的副产物，主要以Fe(II)/Fe(III)的沉淀物或类次生矿物（FeOOH）的形式存在（Gong et al.，2016；Hu et al.，2020），但反应产生的铁化合物与污泥混合，表现为无定型态或结晶较差的颗粒，这与文献报道一致（Gramp et al.，2010）。由图3可知，在反应器运行过程中，对照组Fe(II)/总Fe的比例呈下降趋势，实验组全阶段的Fe(II)/总Fe基本维持在20%－30%范围内，说明NO2-积累的环境使铁的变化比较稳定。综上，通过副产物SO42-的产量相对（理论值或对比试验）下降趋势可以发现，随着NO2-浓度增加，NO2-更倾向于被AnAOB所利用，有利于提高耦合系统的脱氮能力。

2.2 亚硝酸盐对微生物群落的影响

2.2.1 微生物多样性和丰富度分析

AFBR耦合反应器微生物多样性和丰富度如表2所示，实验中9组微生物测序样本覆盖率（Coverage）均大于0.999，能保证测序结果的准确性。Shannon和Simpson指数代表样品多样性，Chao和ACE指数代表样品丰富度。由表2可知，实验组（A2–4和B2–4）的Chao和ACE指数与对照组（A1和B1）数值相当，表明反应器丰富度变化不大。A1–4和B1–4的Simpson指数呈现先上升后下降的趋势，Shannon指数呈现先下降后上升的趋势，一致表明群落多样性先降低后升高，这是因为随着NO2--N浓度的增加，一定量（50－100 mg·L-1）的NO2--N能够满足Anammox的生长需求和调节AnAOB与SOB之间的协同作用，过量（150 mg·L-1）的NO2--N则会对微生物群落造成抑制或胁迫作用（Sijbesma et al.，1996；Wan et al.，2022）。

表2 不同阶段的菌群微生物多样性指数Table 2 Richness and diversity of microbial communities in different phases

2.2.2 微生物群落演替分析

反应器的脱氮性能主要由微生物群落组成结构和功能微生物的功能共同决定。将微生物检测相对丰度>1.00%的菌门作为主要菌门，耦合群落各阶段微生物门水平的组成如图4所示。9组微生物群落中共发现12个主要菌门，主要以Proteobacteria（34.8%－78.4%）为主，其次为Chloroflexi（2.9%－12.1%）、Bacteroidota（2.7%－12.2%）、Actinobacteriota（1.5%－10.2%）等。

图4 门水平的微生物群落相对丰度Figure 4 Relative abundance of microbial community at phylum level

SOB所在的Proteobacteria门是微生物在细菌域分布最广的门类，涵盖多种代谢途径的微生物，如硫自养反硝化菌（SOB，如Thiobacillus、Sulfurifustis等）、异养反硝化菌（HDB，如Denitratisoma、Limnobacter等）、好氧亚硝化菌（AOB，如Nitrosomonas、Ellin6067等）（Sharma et al.，2022）。而AnAOB所在的Planctomycetota门仅占0.26%－1.51%，主要是包括Candidatuskuenenia，Ca.brocadia和Ca.anammoximicrobium（Dedysh et al.，2020），虽然所占比例较少，但是仍能表现出较高的脱氮水平，与Du et al.（2017）的研究结果相似，其厌氧氨氧化反应器中检测的Ca.kuenenia仅占0.23%。其他在厌氧氨氧化系统中常见的菌门包括Chloroflexi门和Bacteroidota门，根据文献（Lawson et al.，2017）报道，前者能够降解AnAOB分泌的蛋白质和多糖类化合物，进一步稳定厌氧氨氧化颗粒污泥的结构，后者主要为反硝化菌群（PHOS-HE36、Ignavibacterium、SJA-28、AKYH767等），能够和AnAOB进行氮交换（NO3-和NO2-），这些功能被认为与AnAOB的代谢实现功能互补，有利于AnAOB的代谢与活性。由图4可知，随着积累的NO2-浓度增加，Proteobacteria门的丰度表现出先升高后降低的趋势，而Planctomycetota门及与AnAOB的共生菌门Chloroflexi和Bacteroidota均表现出丰度先降低后升高的趋势。这表明所积累的NO2-浓度增加促进了SOB的生长而抑制了AnAOB及其共生群落的生长，但这种抑制作用对Anammox的脱氮效果影响不大，系统较高的NH4+-N去除效率验证了以上观点，主要原因可能与酶的活性表达相关。Kartal et al.（2016）认为，AnAOB缓慢的生长速率与Hzs活性密切相关；Wan et al.（2022）认为一定浓度的NO2--N（30 mg L-1）能够促进Hzs基因簇的电子的聚集和转移，使AnAOB代谢相关的酶基因（Hzs，Hdh等）均上调。因此，尽管所积累的NO2-使AnAOB丰度下降，但提高了Hzs基因的表达。

从属水平进一步解释在不同阶段中功能微生物的演替。将微生物检测相对丰度>0.50%的菌属作为主要分析对象，从9组微生物样品中共检测出30个属，图5为属水平的功能微生物热图。由图5可见，对所观察的A1–4和B1–4两组实验，除Thiobacillus，Ca.kuenenia和Desulfurivibrio、SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84外，其他功能微生物菌均表现出从橙色变蓝色的趋势，即丰度在不断下降，尤其在A3–4和B1–4阶段。结合2.2.1节的物种多样性和丰富度的分析，反应器运行期间丰富度几乎不变，而Simpson和Shannon指数一致，表明群落多样性先降低后上升，因此，随着NO2-的氮负荷提高，微生物的功能逐渐具体化，由污染负荷造成的水质环境条件（如NO2-、SO42-、NO3-、NH4+、Fe(II)/Fe(III)等），将对功能微生物进行环境选择，从而优化了群落功能，使耦合系统的脱氮能力显著提高。

图5 属水平上的功能微生物热图Figure 5 Heatmap of functional microorganisms at genus level

具体来说，Ca.kuenenia是典型的AnAOB，参与耦合系统发生Anammox反应，成为能够降解NH4+-N和NO2--N的主要功能微生物，即使呈现一定的下降趋势，但仍能保持一定的丰度和活性（橙色），这在2.1.1节NH4+-N的去除效率中得到验证。Thiobacillus属于典型的SOB，参与耦合系统中的AuDen反应，能够降解NO3--N和NO2--N的主要功能微生物，而Desulfurivibrio则为典型的硫酸盐还原菌，能够还原由AuDen产生的SO42-，两种相对的微生物丰度从深蓝色变成橙色，即丰度上升，C.kuenenia、Thiobacillus以及Desulfurivibrio这三类微生物是耦合系统主要的功能微生物，受到积累程度不同的NO2-浓度的调节。另外，SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等微生物属于水解菌（Rambo et al.，2020），以蛋白质、多糖化合物为食，当水质环境污染负荷胁迫其他微生物的生存时，不少功能微生物丰度下降（橙色变蓝色），甚至死亡，而SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等水解菌就成为这种场景的获益者，尤其是在高浓度的NO2-积累条件（A3–4、B3–4）下，这类水解菌的丰度越高。根据以上数据及分析，可以归纳为：环境（NO2-）不仅影响了微生物种群的结构与功能，相反，微生物种群能够调整结构来适应影响它们的环境。

2.2.3 水质条件与微生物群落之间的相关性

由于物种样品数据的DCA结果显示第一轴轴长为3.88（≥3.50），采用典型相关性分析法（CCA）对AFBR反应器各阶段的进水NO2--N浓度、NH4+-N去除率、NO3--N去除率、出水SO42--S浓度、Fe比例、Anammox和AuDen对TN去除的贡献率等理化性质与关键功能微生物之间的作用关系进行分析，结果如图6所示。红圈代表AnAOB类，紫圈代表SOB类，黄圈代表异养反硝化菌（HDB）类。可以发现，以Ca.kuenenia代表的AnAOB的丰度与NH4+-N的去除率（P=0.0207）、Anammox对TN去除的贡献率（P=0.0418）和Fe比例（P=0.00262）均呈正相关关系，而与NO2--N浓度（P=0.539）呈负相关关系。而SOB的主要优势菌属Thiobacillus与NO2--N浓度（P=0.00533）、SO42--S（P=0.0253）、AuDen对TN去除的贡献率（P=0.0221）呈正相关关系，与NO3--N去除率（P=0.123）、Fe比例（P=0.121）呈负相关关系。NO2--N浓度与Anammox和AuDen对TN去除的贡献率都呈锐角（P=0.00767），因此，NO2-浓度与Anammox、AuDen对总氮的贡献都呈正相关关系。

图6 不同废水水质与脱氮理化性质和群落组成之间的典型相关性分析（CCA）Figure 6 Canonical correlation analysis (CCA) between different wastewater quality and physicochemical properties and community composition of denitrification

此外，以Truepera、Denitratisoma、Limnobacter等为代表的大部分异养反硝化菌与NO3--N去除率、NH4+-N去除率和Anammox对TN去除的贡献率呈正相关关系，虽然耦合系统的主要营养类型为化能自养型，但AnAOB所分泌的物质或死亡的微生物可作为部分异养反硝化菌能量或碳源物质，AnAOB与异养反硝化菌之间也可以进行氮交换。典型的硫酸盐还原菌Desulfurivibrio与硫酸盐浓度呈较强的正相关关系。降解体系中功能微生物群落的独特性与多样化表明，废水水质特征和环境参数决定了微生物群落的组成，所出现的微生物功能网络，极大增强了生态系统的稳定性，而微生物结构与功能稳定性同时受到污/废水溶液性质与环境条件的保护。

3 结论

（1）在Anammox与AuDen耦合的系统中，NO2-积累（ρ(NO2-)/ρ(NH4+)=0－1.50）的环境可明显降低AuDen反应副产物SO42-的产生量，同时显著提高Anammox的反应活性和总氮去除效率，证明了NO2-能够加强AnAOB与SOB之间的协同作用。

（2）NO2-积累的水质条件能够优化群落结构与功能，诱导耦合系统脱氮能力的提高。随着NO2-浓度的增加，主要功能微生物（Thiobacillus、Ca.kuenenia及Desulfurivibrio等）相对丰度稳定或上升，水解菌（SM1A02、1013-28-CG33、SC-I-84等）相对丰度升高，而其他功能微生物相对丰度降低。

（3）相关性分析表明，NO2-浓度与耦合系统中SOB、AnAOB的主要优势菌属分别呈正、负相关关系，且与Anammox、AuDen对总氮去除的贡献都成正相关关系，NO2-是Anammox耦合系统的微生物群落结构与废水理化指标的主控环境化学因子。

（4）NO2-存在的浓度-诱导-适应机制成为影响Anammox与AuDen耦合系统脱氮的驱动力，即环境决定了微生物种群的结构与功能，相反，微生物种群也会通过结构调整来适应影响它们的环境。