红宝石苹果果实有机酸组分及苹果酸代谢酶活性分析

杨光凯 薛诗怡 李嘉祯 李汇斌 高燕 张小军 郝燕燕

摘要：【目的】测定红宝石苹果果实有机酸组成及其含量，分析苹果酸含量变化与其代谢相关酶的关系，探究红宝石果实低酸特性的生理基础。【方法】以不同生长发育期红宝石和富士2001 苹果果实为试验材料，采用蒽酮比色法测定果实总糖含量，高效液相色谱法测定有机酸组分及含量，测定分析果实苹果酸相关代谢酶活性及与苹果酸含量的相关性。【结果】红宝石苹果果实中有机酸成分主要为苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸5 种，与富士2001 苹果果实中有机酸组分一致，其皆以苹果酸为主。不同发育期2 个苹果品种果实中总糖含量相近，但总酸含量差异显著。对果实有机酸不同组分定量分析，发现果实总酸含量差异主要是由苹果酸含量差异所致。进一步分析苹果酸含量与其相关代谢酶活性之间的相关性，发现在发育前期红宝石苹果果实中苹果酸含量大量积累，主要是该时期NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性增强促进了苹果酸的大量合成，以及NADP-苹果酸酶（NADP-ME）活性降低减少了苹果酸的分解，富士2001 苹果与之类似。【结论】红宝石苹果是苹果酸为主的低酸型苹果品种，NADP-ME和NAD-MDH在其果实苹果酸积累中起主要协同调控作用。

关键词：红宝石苹果；有机酸；高效液相色谱；苹果酸代谢酶

中图分类号：S661.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）05-0884-09

苹果是世界四大水果之一，在我国已有两千多年栽培历史。我国苹果种植面积和产量均居世界首位，但在单产和果品质量等方面，与日本、美国、新西兰等国家还存在一定的差距。提高果品品质已成为我国苹果产业高质量发展亟需解决的问题之一[1]。果实糖酸组分及含量是果实风味的重要组成部分，近年来有关果实糖酸形成及代谢调控相关研究已受到广泛关注[2-3]。糖酸比是园艺植物果实风味评价的重要指标，而果实有机酸组分与含量影响着糖酸比[3-4]。

果实有机酸根据碳结构可分为脂肪族羧酸（苹果酸、酒石酸等）、糖衍生有机酸（葡萄糖醛酸等）和酚酸（硝酸、水杨酸等）[5]。大多数园艺植物果实中含有一种或两种主要有机酸，按照成熟果实中有机酸的组分及含量可分为：柠檬酸型（柑橘类水果）、苹果酸型（苹果、梨等）和酒石酸型（葡萄等）[6]。在苹果果实中，苹果酸为主要有机酸，约占总有机酸含量的90%，且野生苹果较栽培苹果酸性更强，果实苹果酸含量变化更大[5，7]。已有研究表明果实苹果酸主要由草酰乙酸（OAA）经苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）作用在细胞质中合成，并通过NAD-MDH和NADP苹果酸酶（NADP-ME）降解为OAA 和丙酮酸[8]。此外，苹果酸还可分别通过三羧酸（TCA）循环和乙醛酸循环在线粒体和乙醛氧体中生成，其合成代谢途径主要受到苹果酸脱氢酶（NAD- MDH）的调控[9-11]。除NAD-MDH外，NADP-ME和PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）在苹果酸代谢中也扮演着重要角色，是苹果酸代谢的关键酶[12]。目前，已在苹果[13-14]、梨[15-16]、桃[17-18]、杏[19-20]、李[21]等多种果实中证实NAD-MDH、NADP-ME和PEPC 3 种酶协同作用影响果实苹果酸的积累。红宝石苹果是山西省农业科学院果树研究所于20 世纪80 年代选育的苹果品种，低酸高糖是其一大特色。课题组前期调查发现，红宝石苹果果实在整个发育期几乎感觉不到酸味，而公认的低酸品种富士2001 苹果则酸味较明显。为探究红宝石苹果果实超低酸特性的生理机制，笔者在本研究中以红宝石苹果和富士2001 苹果果实为试验材料，分析2 个品种果实中有机酸组分、不同发育阶段含量，苹果酸代谢酶活性的差异及动态变化规律，探究红宝石苹果果实低酸的生理基础，为进一步研究红宝石苹果果实有机酸代谢的分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

试验材料为红宝石苹果和富士2001 苹果，成熟期皆为10 月下旬，树龄8 年，乔化栽培，砧木为平邑甜茶，株行距4 m×5 m。分别选取2 个品种长势一致且良好的3 株树进行样品采集。红宝石苹果和富士2001 苹果均于2020 年5 月20 日开始采集样品，共取样7 次，分别为：花后40 d、花后80 d、花后110 d、花后140 d、花后155 d、花后170 d 以及花后200 d。每次取样在每一植株树冠外围不同方向各选取3 个大小较一致，且整体状况良好的果实。样品前处理：果實去皮去核切成小块并混合样品后加液氮速冻，保存于超低温冰箱（-80 ℃），用于总糖、有机酸含量测定及苹果酸代谢相关酶活性分析。

1.2 方法

1.2.1 果实总糖含量测定 果实总糖含量采用蒽酮比色法测定。

1.2.2 果实有机酸含量测定 果实有机酸提取及含量测定参考郭燕等[22]的方法。准确称取1.00 g果肉，加入适量液氮研磨成粉末，加入适量超纯水使提取液达到5 mL，室温水浴超声提取30 min，12 000 r ·min-1离心15 min 后将上清液转移到10 mL的容量瓶中，残渣再加入超纯水5 mL，再次离心15 min，合并上清液，用超纯水定容，提取液过0.45 μm微孔滤膜，利用U3000 型高效液相色谱仪测定有机酸含量。果实总酸含量由各有机酸含量相加计算得出。

色谱条件：色谱柱为Syncronis C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为0.01 mol ·L- 1 KH2PO4，pH 为2.5（磷酸调节）；流速0.5 mL · min- 1；柱温40 ℃；进样量10 μL；检测器为VWD紫外检测器，检测波长215 nm。各有机酸标准品均为色谱纯。5 种有机酸均能在20 min内被完全分离，且峰形正常，分离效果良好。各有机酸被分离的先后顺序依次为草酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸。根据单个标准品的保留时间确定各有机酸组分，各有机酸标准曲线回归方程的R2为0.997 2～0.999 2，线性关系良好，回收率为99.5%～101.5%，精密度较高，符合分析方法的要求。果实中有机酸含量的测定作3 次重复，采用峰面积归一法计算含量，最终含量（w）用mg·g-1表示。

1.2.3 果实苹果酸相关代谢酶活性测定 参照王鹏飞等[23]和史娟等[24]的方法，所有操作在0～4 ℃环境下进行。将1.00 g 果肉加液氮迅速研磨成粉末，加6 mL提取缓冲液[0.2 mol·L-1 Tris-HCl 缓冲液（pH=8.2）、0.6 mol · L- 1 蔗糖、10 mmol · L- 1 异抗坏血酸]，4 ℃下12 000 r ·min-1 離心20 min，取上清液定容至10 mL，取其中5 mL用于测定NAD-MDH（NAD-苹果酸脱氢酶）和NADP-ME（NADP-苹果酸酶）活性，剩余酶液加入透析袋，4 ℃下在大量提取缓冲液中透析过夜，用于测定PEPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）活性。采用UV-2450 型紫外可见分光光度计测定酶活性，以1 min OD值变化0.01 作为1 个酶活性单位，酶活性（以蛋白质计）表示为（U·mg-1），3次重复。

1.2.4 数据处理 用Excel 2010 和Origin 2019 软件进行数据分析和绘图，用DPS数据处理系统进行差异显著性分析（Duncan 新复极差法），应用SPSS 软件进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 果实中可溶性糖含量的变化

由图1 可知，在整个果实发育期，红宝石苹果果实可溶性糖含量的动态变化趋势与富士2001 苹果基本一致，整体呈增加趋势。在果实发育初期（花后40～80 d）和果实发育后期（花后170～200 d）二者可溶性糖含量差异不显著，在花后110 d 可溶性糖含量差异逐渐增大，至花后155 d 可溶性糖含量差异达到最大，此时呈显著差异。在果实整个生长发育期内，红宝石苹果果实可溶性糖含量始终低于富士2001苹果果实。

2.2 果实总酸含量的变化

由图2 可知，随着果实生长发育，红宝石苹果果实总酸含量的变化趋势与富士2001 苹果基本一致，整体呈降低趋势。在果实发育初期（花后40～80 d）先下降，后又缓慢升高。花后140 d，总酸含量达到最高。此后，随着果实的成熟，总酸含量开始下降至果实成熟时（花后200 d）降到最低，但在花后155 d 富士2001 苹果果实总酸含量呈增加趋势，这与红宝石苹果果实趋势相反。在整个果实生长发育期内，红宝石苹果果实总酸含量始终低于富士2001 苹果果实，且差异显著。

2.3 果实有机酸含量的变化

2.3.1 苹果酸 由图3可知，苹果酸是红宝石苹果和富士2001 苹果果实最主要的有机酸，其含量在2 个品种果实整个生长发育过程中比例均较高，且含量变化趋势与总酸基本一致。2 个品种果实中苹果酸含量的大量积累主要在果实发育前期，随着果实成熟，苹果酸含量逐渐降低。不同的是，红宝石苹果果实在花后140～170 d苹果酸含量缓慢降低，而富士2001苹果果实在同一时期却先降低后升高。果实发育初期，红宝石苹果果实苹果酸含量为3.15 mg·g-1，占总酸的89.03%，果实成熟时占总酸的91.80%，富士2001 苹果果实苹果酸含量是红宝石苹果果实的2.41～4.63倍。在整个发育过程中，红宝石苹果果实苹果酸含量始终显著低于富士2001 苹果果实。

2.3.2 柠檬酸 由图4 可知，在果实整个发育过程中，2 个品种果实柠檬酸含量整体均呈降低趋势，且含量均较低。在果实发育初期，红宝石苹果果实柠檬酸含量先升高后降低，而富士2001 苹果果实先降低后升高。在果实膨大期（花后110～140 d），二者果实柠檬酸含量及变化趋势相近，均呈下降趋势。在花后140～170 d，红宝石苹果果实柠檬酸含量先缓慢升高后迅速降低，而富士2001 苹果果实柠檬酸含量呈下降趋势。花后170～200 d 二者果实柠檬酸含量缓慢升高。此时，红宝石苹果果实柠檬酸含量占总酸的2.35%，而富士2001 苹果果实柠檬酸含量占总酸的0.79%。

2.3.3 草酸 由图5 可知，红宝石苹果和富士2001苹果果实草酸含量在花后80～140 d 变化趋势较为相近，而花后140～200 d 变化趋势差异较大。红宝石苹果果实中草酸含量在果实发育初期变化不大，花后140～170 d 含量急剧升高，在花后170 d 达到最高0.024 mg· g-1，而后呈下降趋势，花后200 d 草酸含量为0.012 mg · g-1。而富士2001 苹果果实草酸含量从花后40～140 d 呈降低趋势，含量为0.008～0.000 9 mg · g-1。随后保持平稳，直至果实成熟。

2.3.4 酒石酸 由图6 可知，在整个果实发育时期，红宝石苹果和富士2001 苹果果实酒石酸含量变化趋势类似。在果实发育初期二者果实酒石酸含量均呈现先增加后减少的趋势，在花后140～155 d，二者酒石酸含量急剧升高并达到最高，分别为0.019 mg·g-1和0.015 mg·g-1，后又急剧下降。不同的是，红宝石苹果果实在花后170 d 酒石酸含量下降趋势渐缓，而富士2001 苹果果实在花后155 d 整体呈现迅速下降趋势。直至果实成熟时，红宝石苹果果实酒石酸含量为0.011 mg·g-1，高于富士2001 苹果果实酒石酸含量的0.001 3 mg·g-1。

2.3.5 琥珀酸 由图7 可知，在果实整个生长发育时期，红宝石苹果及富士2001 苹果果实中琥珀酸含量变化整体呈降低趋势。红宝石苹果果实琥珀酸含量在果实发育初期为0.288 mg· g-1，占总酸的8.36%，随着果实的生长发育，至果实成熟时含量为0.121 mg·g-1。2 个品种果实中琥珀酸含量均在幼果期迅速下降，直至果实膨大期又缓慢上升。不同的是，在花后140～170 d 红宝石苹果果实琥珀酸含量先上升后下降，花后170 d 后琥珀酸含量又逐渐上升，而富士2001 苹果果实柠檬酸含量变化趋势与红宝石苹果果实相反。

2.4 苹果酸代谢相关酶活性的变化

2.4.1 NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH） 由图8可知，在果实整个生长发育期，红宝石苹果和富士2001 苹果果实中NAD-MDH活性变化趋势较为相似。幼果期二者果实酶活性变化趋势基本一致，NAD-MDH活性均出现不同程度降低，花后155 d 活性突然升高，至花后170 d 活性达到最高，其中红宝石苹果果实为2 827.49 U·mg-1，富士2001 蘋果为4401.66 U·mg-1。在果实整个生长发育阶段，红宝石苹果果实NAD-MDH活性一直低于富士2001 苹果。

2.4.2 NADP-苹果酸酶（NADP-ME） 由图9 可知，红宝石苹果和富士2001 苹果果实中NADP-ME活性变化差异较大，整体趋势大致相反。红宝石苹果果实中NADP-ME活性在果实发育初期先降低，后呈现一直升高的状态，至果实成熟期（花后200 d）达到最高，为5.08 U·mg- 1。而富士2001 苹果果实中NADP-ME活性在果实发育初期（花后80 d）和花后155 d 均呈先增高、后降低趋势，在花后140 d 活性最低，为0.21 U·mg-1。

2.4.3 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC） 由图10可知，红宝石苹果和富士2001苹果果实中PEPC活性变化差异较大。红宝石苹果果实中PEPC活性变化趋势整体呈W形，在幼果期，PEPC活性迅速降低，在花后80 d又缓慢升高，花后110 d后又逐渐下降至最低，为19.09 U·mg-1，随着果实成熟，PEPC活性又逐渐升高，直至果实成熟。除花后145～170 d，其余时期红宝石苹果果实酶活性均高于富士2001。富士2001苹果在果实发育初期PEPC活性迅速降至最低，为23.54 U·mg-1，之后又缓慢升高，在果实成熟期趋于稳定。

2.4.4 果实中苹果酸含量与其代谢酶活性相关性分析 对红宝石苹果和富士2001苹果果实的苹果酸含量和其代谢酶活性进行相关性分析（表1），红宝石苹果和富士2001 苹果果实中NAD-MDH活性与苹果酸含量的变化呈极显著正相关，相关系数分别为0.78、0.66；NADP-ME活性与苹果酸含量的变化呈极显著负相关，相关系数分别为-0.67、-0.81；而果实中PEPC活性与苹果酸含量的变化呈显著正相关，相关系数分别为0.76、0.69。

3 讨论

果实风味是衡量果实品质的重要指标，其受果实中有机酸组分及含量的影响[25]。果实中有机酸组分及含量受遗传特性、生态条件及栽培管理水平的影响[5，16-17]。刘清鹤等[15]的研究发现梨果实中有机酸主要由苹果酸、柠檬酸、酒石酸和奎宁酸组成，为苹果酸优势型。桃果实中有机酸主要由苹果酸、柠檬酸、奎宁酸和莽草酸组成，苹果酸含量最高，约占总酸含量的60.61%[26]。葡萄果实主要有机酸为酒石酸、苹果酸和柠檬酸[27]。高萌[28]的研究发现43 个栽培苹果品种果实中苹果酸含量为1.72～10.10 mg·g-1，而红宝石苹果成熟期果实总酸含量为2.48 mg·g-1，为低酸型品种。笔者在本研究中发现，红宝石苹果果实中有机酸主要为苹果酸、草酸、柠檬酸、酒石酸和琥珀酸，这与徐爱红等[29]在红富士苹果中研究一致。相较于富士2001 苹果，红宝石苹果总糖含量与之相近，但有机酸含量在整个果实发育期均显著低于富士2001苹果，这也是其风味较浓郁的主要原因。

在果实生长发育过程中，总糖、有机酸是影响果实糖酸风味的重要因子[30-31]。本研究中红宝石苹果果实中总糖含量变化规律与富士2001 苹果基本一致，呈不断增加趋势，至成熟期达到最高。2 个品种果实总酸含量存在较大差异，在整个果实发育期红宝石苹果果实苹果酸含量占总酸含量的89%，富士2001 苹果则为97%；但富士2001 苹果成熟果实总酸含量约是红宝石的2.54 倍。由此可知二者总酸含量的差异主要是由苹果酸含量的差异所致。红宝石苹果果实中苹果酸含量在整个发育过程中呈现降低-升高-降低的趋势，且始终显著低于富士2001 苹果。此外，红宝石苹果果实中还有一定含量的柠檬酸、酒石酸、琥珀酸和草酸，其含量均高于对照品种富士2001 苹果。其中柠檬酸、酒石酸和琥珀酸三者含量变化趋势与富士2001 苹果类似，但红宝石苹果果实中草酸含量在果实发育后期先急剧升高，后急剧下降，富士2001 苹果草酸含量变化则呈现缓慢下降的趋势，这种差异成因有待进一步研究。

果实生长发育过程中苹果酸含量变化由NADMDH、NADP-ME、PEPC、CS（柠檬酸合酶）等多种代谢酶共同调控，且受遗传特性与自然环境的影响[21，23，29]。笔者在本研究中发现，红宝石苹果果实中NAD-MDH、PEPC活性与苹果酸含量存在极显著或显著正相关关系，而NADP-ME活性与苹果酸含量存在极显著负相关关系，这表明红宝石苹果果实苹果酸含量变化受到PEPC、NAD-MDH、NADP-ME 3种酶共同调控，这与史娟等[24]在红富士苹果中的研究结果较一致。在果实整个发育期，红宝石苹果果实中NAD-MDH活性变化趋势与富士2001 苹果相近，但NAD-MDH 活性一直显著低于富士2001 苹果，这可能是2个品种果实发育期果实苹果酸含量较大差异的重要因素。在果实发育后期，红宝石苹果和富士2001 苹果果实中苹果酸降解关键酶NADP-ME活性均迅速升高，且红宝石苹果果实NADP-ME酶活性显著高于富士2001 苹果。综上可知，NADMDH和NAD-ME活性差异是红宝石苹果果实苹果酸含量显著低于富士2001 苹果的主要原因。

4 结论

红宝石苹果果实中有机酸组分包含苹果酸、柠檬酸、草酸、酒石酸和琥珀酸等5 种，且主要有机酸为苹果酸，与富士2001苹果一致。红宝石苹果果实总糖含量与富士2001苹果相近，但有机酸含量显著低于富士2001 苹果，属低酸型特异种质资源。红宝石苹果和富士2001苹果果实中苹果酸含量差异主要是果实发育期NAD-MDH和NADP-ME活性差异所致。

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