Notch信号通路与肝癌相关的研究进展

吕川川，方永平，李坤平

1.广东医科大学，广东 湛江 524023；2.广东医科大学惠州第一临床学院，广东 惠州 516000

原发性肝癌是一种侵袭性癌症，其死亡率在恶性肿瘤中居第二位，是全球癌症相关死亡第三大常见原因，严重威胁人类的生命健康和社会发展［1］。肝细胞性肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要组织学亚型，占原发性肝脏恶性肿瘤总病例的90%以上。中国是肝癌的高发国家之一，全球约一半的新发和死亡病例都发生在中国［2-3］，但目前对肝癌相关信号通路的研究仍未十分明确，因此对肝癌信号通路的研究仍是近期研究热点，以便为HCC患者找到更有效的治疗方式。

Notch 信号通路是一条极其复杂的调控通路，其调控机体内多细胞的分化、增殖和凋亡，对肝脏血管、胆管和免疫细胞的发育也有很大影响［4］。近年来，越来越多的研究表明，Notch 信号通路的异常与肝癌的发生发展存在着密切的联系，因此，对其进行深入的研究显得十分重要。在此，本文将从Notch 信号通路的组成，Notch 信号通路激活以及Notch信号通路在肝癌中的作用做一综述。

1 Notch信号通路

1911年，Morgan 和他的同事首次描述了由于X 染色体上一个基因的杂合子缺失而导致果蝇翅膀边缘有一个缺口，这个缺口后来被命名为“Notch”。1985 年，Wharton和他的同事对Notch 的结构和功能进行了初步描述，发现它是一种细胞内通路，参与多种细胞过程，其异常导致了大量的人类疾病，从遗传性疾病到各种恶性肿瘤（乳腺癌、肺腺癌、肝细胞癌、卵巢癌、结直肠癌以及多种血液恶性肿瘤）都发现Notch 信号通路的调节异常［5］。Notch 信号通路是一条进化上高度保守的信号通路，其通过邻近细胞的相互作用，从一个细胞上的跨膜配体激活另一个细胞上的跨膜受体，而且其也是许多重要信号通路的交点。近年来，Notch 信号通路成为肝癌研究的重点和难点，该条信号通路有望成为肝癌治疗的新靶点。

2 Notch信号通路的组成

Notch 信 号 通 路 由Notch 受 体、Notch 配 体（DSL 蛋白）、细胞内效应器分子（CSL蛋白）组成。

（1）受体：Notch 受体是单通道I型跨膜蛋白。哺乳动物有4 个Notch 受体（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4），果蝇有1 个Notch 受体（dNotch），线虫有2 个Notch 受体（LIN-12， GLP-1）。Notch1 和Notch2 在哺乳动物的许多组织中广泛表达，Notch3 在血管平滑肌和脑周细胞中含量最高［6］，而Notch4 在内皮细胞中含量最高。Notch 受体是后生动物短距离细胞信号系统的一部分，包括一个大的胞外区域（NEC）和一个短的胞内区域（NTM），NTM 分为跨膜区（TM）和胞内区（ICN），NTM 在Notch信号通路中发挥着与下游效应蛋白的核定位和蛋白稳定性等作用。NEC 是与配体结合的区域，包含一组相邻的表皮生长因子（EGF）结构域和膜近端负调控区（NRR）。在EGF 结构域重复区中包括结合Ca2+的EGF 结构域和非结合Ca2+的EGF结构域。在EGF 结构域之后是3 个富含半胱氨酸的Lin-12-Notch（LNR）重复序列和两个介导异二聚化（HD）的疏水区域（HD-N、HD-C） 以及位点1（S1） 和位点2（S2） 切割位点，一起形成与细胞膜相邻的负调控区（NRR）。该区域通过隐藏和保护S2切割位点免受金属蛋白酶的影响，防止Notch 受体的配体非依赖性激活，即在没有配体的情况下，NRR 发挥着阻止受体激活。NRR 在Notch1 和Notch2 中 也 不 同，HD-N、HD-C 和LNR-C 在Notch1NRR 中包含氢键，而在Notch2NRR 中存在Zn2+配位位点。S1 位点位于HD 亚结构域突出的非结构化环内。位点3（S3）切割位点位于跨膜片段内，并被γ-分泌酶复合物切割以释放Notch 胞内结构域（NICD）。NICD 是一种转录共激活因子，包含一个J-kappa（RBP-J）-结合分子（RAM）结构域的重组信号结合蛋白、7个锚蛋白重复序列（ANK）、核定位信号（NLS）、一个转录激活结构域（TAD）以及富含脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸残基（PEST） 序列的区域。RAM 结构域和ANK 重复序列均已被确定为与CSL 转录因子相互作用的区域。TAD 区域存在于Notch1 和Notch2 中，但哺乳动物的Notch3 和Notch4中不存在。C 末端PEST 结构域通过蛋白水解参与NICD 降解［7］。EGF 结构域的数量因物种而异，Notch 受体的数量也因物种而异，但其分子结构是相似的。哺乳动物中Notch 蛋白的胞外结构域包含29～36 个串联EGF 样重复序列，Notch1 和Notch2 含有36 个EGF，Notch3 和Notch4 分别含有34 和29 个EGF。Notch（1～4）受体的差别主要集中EGF上，这些差别是受体与配体有效结合所必需的。这些EGF 重复序列包含添加N 连接聚糖和O 连接聚糖的位点。研究表明，Notch1 和Notch2 只有53%的氨基酸相似性，区分Notch1 和Notch2 的差异可能取决于Notch 激活的整体强度［8］。（2）配体：Notch 配体也是单通道I 型跨膜蛋白。哺乳动物的基因组有2 类同源基因的5 种Notch 配体， 即3 个Delta 样 配 体： Delta-like1、 Delta-like3、Delta-like4 （DLL1、DLL 3、DLL4），和2 个Serrate 样配体：Jagged1、Jagged2（JAG1、JAG2），它们统称为DSL蛋白。果蝇中有2 个典型的配体：Delta 和Serrate。线虫有4 种 配体：LAG-2、APX-1、ARG-1 和DSL-1。Delta样配体是由EGF 重复序列、Delta SerrateLAG2（DSL）域和氨基末端（NT）域3 部分组成。Serrate 样配体是由富含半胱氨酸的结构域（CRD）、EGF 重复序列、DSL 域和NT 域四部分组成。DSL 配体的EGF 重复序列由6-16 不等。DSL 和NT 是Notch 受体-配体相互作用的位点。NT结构域具有磷脂结合的特性，参与邻近细胞膜的相互作用［9］。有趣的是，在5 种配体中，DLL3 表现出与其他配体明显的差异，DLL3 定位在高尔基体中，在过度表达时出现在细胞表面。DLL3 不与Notch 受体结合，但在顺式中使Notch 信号失活。DLL3 还通过细胞内滞留阻止Notch和/或DLL1 在细胞表面的定位。因此，DLL3 被认为是Notch 信号传导的细胞自主抑制剂。它也是ASCL1 的直接下游靶标，ASCL1 是一种与肺神经内分泌细胞发育相关额转录因子。这些发现表明DLL3 与神经内分泌肿瘤发生有关，尤其是在肺癌中［10］。（3）细胞内效应分子：CSL通常指的是同源蛋白家族有3 个同源物：哺乳动物中为CBF-1，又称为RBP-JK（重组结合蛋白Jk），果蝇中为Su（H）（无毛抑制蛋白），线虫中为Lag1。CSL 蛋白由3 个结构域组成，分别为N 端结构域（NTD）、β-三叶型结构域（BTD）和C 端结构域（CTD）。它们由一条长β 链连接，将各个结构域整合成一个独特的奇异折叠。CSL 中的NTD参与DNA 结合，CTD 参与蛋白质-蛋白质相互作用，而BTD 与NTD、CTD 一起参与DNA 结合和蛋白质-蛋白质相互作用。BTD与其他含β-三叶结构域的蛋白质相比，其包含白细胞介素-1 和成纤维细胞生长因子家族。典型的β-三叶形褶皱是一个β-桶状结构，由12 个β-链组成，其中4 个β-链组以假三重对称排列方式排列，3 个β-发夹形成帽状结构。然而，在Notch 信号传导中BTD 还发挥着另一个重要作用，远离DNA 的BTD 的表面上不存在来自帽的两条β链，留下一个暴露在表面的疏水袋，这是用于结合其他蛋白质的位点［11］。CSL 在Notch 信号通路中发挥着关键作用，Notch 细胞内结构域（NICD）异位到细胞核后，CSL 形成多个复合物，其中一些复合物可以通过NICD 被Notch信号激活，而另一些复合物则对NICD不敏感［12］。

3 Notch信号通路的激活

Notch 信号通路的激活是通过Notch 受体与邻近细胞中的配体相互作用来实现的，这种相互作用需要经过3 次酶切割过程完成。首先，Notch 受体前体蛋白在内质网合成，新合成的Notch 蛋白被糖基化，然后在高尔基体内被furin蛋白酶转化酶（弗林蛋白酶）在S1 位点进行第一次切割，形成NEC 和NTM，它们通过HD 的N-端和C-端之间的非共价相互作用结合在一起。S1 切割可能发生在NRR 分泌途径中。在到达信号接收细胞表面后NECD 与来自信号发送细胞的配体结合，配体内吞进入信号发送细胞，然后对Notch 施加压力，导致Notch 异二聚体解离以及ADAM17 蛋白（也称肿瘤坏死因子-α 转化酶，TACE）对Notch 在S2 进行第二次切割，N 端裂解片段被配体细胞所吞噬，C 端裂解片段被γ-分泌酶复合物（包含早老素蛋白1/2，呆蛋白，PEN-2蛋白和Aph-1蛋白）在S3/S4位点进行第三次切割，切割的NICD 从膜上释放出来，然后异位到细胞核，结合KappaJ 区的信号免疫球蛋白（signal binding proteinforimmunoglobulin kappaJ region，RBPJ）、操纵子样蛋白家族（Mastermind-like family membrs，MAML1）以及其他激活物共同形成Notch 转录激活物复合物以诱导Notch 靶基因的表达［13-14］。

4 Notch信号通路在肝癌中的研究

Notch 信号在正常肝脏发育和肝脏肿瘤形成中都发挥着重要作用。目前，Notch 信号在肝癌中的作用存在争议，一些研究认为，Notch 信号在HCC 中起到肿瘤抑制因子的作用［15］。然而，更多的证据支持Notch 在肝癌发展中的致 癌 作 用。 Liu 等［16］发 现 Synaptojanin 2 结 合 蛋 白（SYNJ2BP）通过激活DLL4 介导的Notch 信号通路来抑制HCC 的生长和转移。Han 等［17］发现首次表明miR-449a 是反映HCC 恶性程度的短期复发相关miRNA，可以直接通过与其mRNA 的3′UTR 结合来靶向Notch1 使Notch 信号通路失活，并通过调节上皮间质转化（EMT）在体外和体内抑制HCC细胞的侵袭和迁移。Sarah等［18］研究发现在HCC中Notch有效诱导靶基因HES5表达，并且表现出促肿瘤和抗肿瘤作用。在MYC 诱导的HCC 中，HES5 抑制HCC 生长，而在AKT 诱导的HCC 中，则促进肿瘤形成。在Nakano等［19］研究中，证明了Notch的两种配体Dll4和Jag1在调节HCC 进展中表现出相互拮抗作用。实验中使用二乙基亚硝胺（DEN）诱导的肝癌发生模型表明，Dll4 的缺乏使Notch1 信号通路失活并抑制HCC 的进展。相比之下，敲除Jag1 导致Dll4 在其他不表达的肝细胞中异位表达，同时丢失Notch2 信号，促进HCC 的进展。这些结果表明，两组不同的Notch 配体和受体对HCC 的进展会产生相反的影响。

肿瘤微环境（TME）在调节肝纤维化、肝癌发生、上皮间质转化（EMT）、肿瘤侵袭和肿瘤转移中发挥着不可或缺的作用［20］。Tspan5 通过增加由γ-分泌酶催化的Notch S3 位点的切割来激活Notch 信号，增强Notch 依赖性EMT 来促进HCC 的细胞迁移和肿瘤转移［21］。在HCC 肿瘤微环境中发现的细胞类型主要包括肝星状细胞（HSC）、癌症干细胞（CSC）、免疫细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）和癌症相关成纤维细胞（CAF）等［22］。CSC 参与HCC 的生长和转移，HIF 1-α 通过激活Notch1 诱导EMT 促进HCC 的CSC 特征［23］。TAM 通过释放促肿瘤细胞因子促进肿瘤的发展，在HCC 进展和转移中起关键作用。在Hepa1-6 HCC 模型中骨髓特异性Notch 缺乏不仅可以通过增加局部Kupffer 细胞样TAM（kclTAM）增殖来补充单核细胞TAM 的减少，而且还可能引起kclTAMs的更强的促癌活性，参与加速HCC生长，但这一结论还需要其他HCC 细胞系来证实［24］。CAF 在癌细胞与肿瘤微环境之间起着至关重要作用，CAF分泌的IL-6通过STAT3磷酸化激活Notch信号通路，从而促进HCC进展。

异常的Notch 信号传导是HCC 肿瘤发生、发展的重要因素。有研究首次证实表皮生长因子样结构域（EGFL）基因家族成员参与HCC。此外，他们进一步发现EGFL8的下调与HCC 的进展和预后不良相关，并通过激活Notch 信号通路调节HCC 细胞迁移、侵袭和凋亡，但EGFL8 对肝癌细胞凋亡的促进作用较弱，表明EGFL8 可能是HCC 一种新的治疗靶点和潜在的预后标志物。一项研究［25］发现GPR50 在HCC 中过表达，并且GPR50 敲低可以通过下调Notch信号通路来抑制HCC进展。他们的研究结果还表明，GPR50 与去整合素和金属肽酶结构域17（ADAM17）形成一种新型分子复合物，调节ADAM17活性，以不依赖配体的方式激活HCC 中的Notch 信号通路。哺乳动物的直系同源物（ENAH）是一种肌动蛋白结合蛋白。从功能上讲，ENAH 有助于HCC 的细胞增殖、侵袭和迁移。从机制上讲，剪接因子3b亚基4（SF3B4）作为ENAH 的RNA 结合蛋白并在HCC 中正向调节ENAH。此外，SF3B4 调控的ENAH 通过激活Notch信号促进HCC的发展。环指蛋白187（RNF187）是一种含有RING 结构域的泛素E3 连接酶，是Notch1促进HCC侵袭和转移的重要因子，它通过诱导HCC细胞的上皮间质转化促进HCC 转移。Chen 等［26］研究表明长链非编码RNA（lncRNA）RUSC1-AS1 通过Notch3 轴激活Notch 信号通路，促进HCC 细胞增殖，抑制HCC 细胞凋亡，从而发挥致癌的作用。

综上所述，Notch 信号通路在肝癌中的作用是作为肿瘤抑制因子还是肿瘤促进因子已初步达成共识，但其在肝癌当中具体的分子机制仍需深入探究。随着科学技术的进步和发展，我们定会明确Notch 信号通路在肝癌中的具体分子机制，这将为肝癌靶向治疗提供新的靶点，为肝癌的预防提供新的方向。