PCR联检呼吸道常见病原体在呼吸道感染早期诊断中的价值

赵亚玲

【摘要】  目的    探讨多重实时荧光PCR法联检13种呼吸道病原体在呼吸道感染早期诊断中的价值。方法    收集天水市第一人民医院2021年8月—2022年4月共312例呼吸道疾病住院患者作为研究对象，同时采集咽拭子及深部痰液样本，均接受呼吸道病原体核酸检测，分析上呼吸道疾病及下呼吸道疾病病原体核酸检测结果。结果    在312份呼吸道样本中有274份检测到病原体，检出率为87.82%，其中有59份（阳性占比21.53%）样本中检测到两种及以上病原体。上呼吸道疾病共42例，检测到病原体33例，检出率为78.60%，病原体核酸检出率前三位为乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒。下呼吸道疾病共270例，检测到病原体241例，检出率为89.30%，病原体核酸检出率前三位为肺炎链球菌、呼吸道合胞病毒、流感嗜血杆菌。结论    通过多重实时荧光PCR法对引起呼吸道疾病的常见病原体进行核酸检测，能辅助临床快速定位病原体，确定感染类型，为呼吸道感染疾病的早期诊断提供实验室依据。

【关键词】  呼吸道感染；早期诊断；常见呼吸道病原体；PCR联检

The value of PCR in the early diagnosis of respiratory tract infection

Zhao Yaling. The First People's Hospital of Tianshui City，Tianshui，Gansu   741000

【Abstract】  Objective    To evaluate the value of multiple real-time PCR for detection of 13 respiratory pathogens in early diagnosis of respiratory tract infection. Methods    A total of 312 inpatients with respiratory diseases were collected from August 2021 to April 2022 in our hospital as the research subjects，and deep sputum samples and throat swab samples were collected，and nucleic acid test results of pathogens of upper and lower respiratory diseases were analyzed.Results    Pathogens were detected in 274 of 312 respiratory tract samples，with a detection rate of 87.82%，and two or more pathogens were detected in 59 samples（positive ratio 21.53%）.There were 42 cases of upper respiratory diseases，33 cases of pathogens were detected，and the detection rate was 78.60%.The top three pathogens in nucleic acid detection rate were influenza B virus，respiratory syncytial virus and human rhinovirus.There were 270 cases of lower respiratory tract diseases，and 241 cases of pathogens were detected，with a detection rate of 89.30%.The top three pathogens in nucleic acid detection rate were Streptococcus pneumoniae，respiratory syncytial virus and Haemophilus influenzae.Conclusion    Nucleic acid detection of common pathogens causing respiratory tract diseases by multiplex real-time fluorescence PCR can assist the clinical diagnosis of respiratory tract infectious diseases to quickly locate pathogens，determine the type of infection，and provide laboratory basis for the early diagnosis of respiratory tract infectious diseases.

【Key Words】  Respiratory infections；Early diagnosis；Common respiratory pathogens；Real-time PCR

中图分类号：R446.5        文献标识码：A        文章編号：1672-1721（2023）13-0065-04

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.13.021

呼吸道疾病是临床高发疾病，尤其是幼儿及老年人等免疫力低下人群，发病率高、致死率高。其特点是不同的病原体可以引发相同的呼吸道症状，而不同的临床症状也可能是由一种病原体引起的，且引起呼吸道疾病的病原体种类繁多，构成复杂，而且时有多种病原体混合感染的情况[1]。致使临床医生难以锁定病原体，造成诊治困难，延误治疗，并且易带来由于经验用药或预防用药引发的细菌耐药性显著增加及抗生素滥用问题[2-3]。美国卫生计算与评估研究所（IHME）发布的报告当中，2017年全球有4.7亿人发生呼吸道感染，是一个非常高发的疾病，全球有390多万人因呼吸道感染而死亡，中国占到101万人，从死亡人群年龄分布上看，以70岁以上的老年人为主，占68.9%，5岁以下儿童也有很高的死亡率，占11.7%。引起呼吸道感染的病原体主要有细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体，立克次体等[4]，而现阶段实验室检测呼吸道病原体的方法主要是细菌培养法和血清学检测抗原抗体法以及单一病原体核酸检测法，它们或检测周期长、阳性检出率低，或窗口期长、假阴性率高，或检测结果单一，一次只能鉴定一种病原体。临床急需一种准确率高、检测周期短、涉及病原体种类较多的病原学检测方法，能够准确且快速地定位病原体，较少临床误诊及漏诊。本研究通过多重实时荧光PCR技术，对13种常见呼吸道病原体靶基因进行扩增和检测，同时收集患者临床资料，结合临床指标综合分析，评价其在呼吸道感染疾病早期诊断中的应用价值。

1    资料与方法

1.1    一般资料    选取2021年8月—2022年4月天水市第一人民医院收治的312例呼吸道疾病住院患者为研究对象，临床症状主要为发热、咽喉痛、流涕、咳嗽咳痰、呼吸不畅，伴或不伴胸痛，胸部影像学检查及临床查体提示呼吸道感染。其中上呼吸道疾病42例，下呼吸道疾病270例。

1.2    方法

1.2.1    標本采集    咽拭子采集方法：无菌棉拭子拭取双咽扁桃体及咽后壁，将拭子置入患者采样液（无菌生理盐水）的采样管中，将试管塞紧后，密闭送检。痰液收集方法：清晨漱口，咳深部痰于无菌痰盒中，盖紧盒盖，密闭送检。

1.2.2    仪器和试剂    选用美国ABI7500实时定量PCR扩增仪、SLAN-96P扩增仪、全自动核酸提取仪，湖南圣湘生物科技有限公司七项呼吸道病原菌核酸检测试剂盒、六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒。

1.2.3    多重荧光PCR法联检    采用多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），六项呼吸道病原体核酸检测是利用针对待检测病原体核酸保守区设计的特异性引物、特异荧光探针，配以PCR反应液等组分，在荧光定量PCR仪上，应用多重实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现对样本中的呼吸道病原体核酸的快速检测。七项呼吸道病原菌核酸检测是基于Taq酶水解荧光探针产生荧光信号及带荧光产物杂交产生荧光信号两种技术原理，针对单色荧光通道中一个目标靶点的检测采用荧光探针，另一个目标靶点的检测采用溶解曲线的方式，从而实现在单色荧光通道中同时进行两个目标靶点的检测和分析。

1.3    观察指标    统计不同类型呼吸道感染疾病的病原体核酸检测结果，观察并总结差异，另外对引起上、下呼吸道疾病的多重感染病原体进行分析。

2    结果

在312份呼吸道样本中有274份检测到病原体，检出率为87.82%，其中有59份（阳性占比21.53%）样本中检测到两种及以上病原体。

2.1    引起上呼吸道感染的病原体结果分析    上呼吸道感染病例共42例，检测到病原体的样本为33例，检出率为78.60%，其中有11例样本中检测到两种病原体。病毒是引起上呼吸道感染的主要病原体，检出率最高的是乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒也占有较高的检出比例，余检出病原体依次为人鼻病毒、腺病毒、甲型流感病毒、肺炎支原体，见表1。

2.2    引起下呼吸道感染的病原体结果分析    下呼吸道感染病例共270例，检测到病原体的样本为241例，检出率为 89.30%，其中有48例检测到两种及以上病原体。病毒和细菌均是引起下呼吸道感染的主要病原体，检出率最高的细菌是肺炎链球菌，检出率最高的病毒是呼吸道合胞病毒，余检出病原体依次为流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、人鼻病毒、乙型流感病毒、腺病毒、铜绿假单胞菌、肺炎支原体，见表2。

2.3    不同部位多重病原体感染结果分析    通过实验检测发现，在11例（阳性占比33.33%）诊断为上呼吸道感染的患者和48例（阳性占比19.92%）诊断为下呼吸道感染的患者中存在两种及以上病原体的混合感染。最常见的多重感染包括呼吸道合胞病毒、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和人鼻病毒，部分病例还涉及到腺病毒、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体的混合感染，见表3。

3    讨论

呼吸道感染疾病是全球公共卫生难题，感染人群庞大，治愈不易，严重者可致全身性脓毒血症感染，预后差[5]。造成此现象一个非常重要的原因是不能在疾病初期准确定位病原体，延误甚至错误治疗，从而导致疾病持续发展。与此同时，因为不能正确进行针对性治疗，就会采用经验性抗生素治疗，从而又引发了另一个严重的全球关注的公共卫生问题，即抗生素滥用，细菌耐药与日俱增，药物用无可用。因此，如何准确且快速地找出病原体就显得尤为重要。近几年来随着分子领域的快速发展，运用分子生物学技术，将高通量核酸检测技术运用到呼吸道病原体检测中，对呼吸道疾病的诊疗具有重要意义，可为临床提供准确的实验室依据。

本研究选取有典型呼吸道临床表现的患者312例，其中上呼吸道疾病42例，下呼吸道疾病270例。42例上呼吸道感染的病例中有33例检测到病原体，检出率为78.57%，检出率最高的为甲型流感病毒，其余依次为呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、乙型流感病毒、副流感病毒、腺病毒以及肺炎衣原体。270例下呼吸道感染的病例中有241例检测到病原体，检出率为89.26%，检出率最高的为肺炎链球菌，其余依次为呼吸道合胞病毒、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、人鼻病毒、乙型流感病毒、腺病毒、铜绿假单胞菌、肺炎支原体。本次研究中未检测出嗜肺军团菌和百日咳杆菌，该两种细菌是临床中较难用常规细菌方法培养及鉴定的菌种，后续还需继续扩大研究样本量，验证实时荧光多重PCR方法对这两种菌的检出率，完善有关数据。

本研究数据显示，该方法不仅对检测病毒有很高的敏感性及检出率，而且对细菌的检出率也明显高于传统的细菌培养法，尤其是肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等苛养菌的阳性率明显高于培養法。但研究也存在一些弊端，细菌检测种类较少，缺少临床呼吸道感染中常见的一些致病菌，如鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等。本研究发现上呼吸道感染的主要病原体为病毒，其同时也是下呼吸道感染的重要病原体，提示临床对于肺炎的诊断应考虑到病毒性肺炎的存在，选择有效的检查手段，合理使用抗生素，遏制细菌耐药的产生。另外还发现在呼吸道疾病中存在较多的病原体混合感染情况（阳性占比21.53%），包括病毒和病毒、病毒和细菌、病毒和支原体的混合感染。值得注意的是，呼吸道合胞病毒在上、下呼吸道的混合感染中都占了较大的比例，与殷海珍的研究结果相似[6]。此病毒是引起婴幼儿支气管和肺部感染的重要病原体，也可引起成人呼吸道感染症状，有报道指出呼吸道合胞病毒感染能够导致呼吸道微生态紊乱，菌落构成改变，从而加重患者临床症状[7]。腺病毒血清型多样，可引发儿童肺部严重感染致呼吸衰竭，且该病毒还可见肺外临床表现如肝肿大、肾病等，而现阶段实验室对此病毒抗原检测的检出率普遍较低，造成较多的临床漏检[8]。这也是和传统检测方法相比，多重核酸检测技术的一大优点，可以用最少的样本量对多种病原体进行联合检测，有效减少了样本的用量，提高了检测的便捷度与灵敏度，通过对多种常见病原体的同时检测，缩短检测周期，降低检测成本，减轻了患者的经济负担，同时科室方面也加快了病床的周转，可以服务于更多的患者。但由于受样本采集质量，正确转运及存放条件对检测CT值的影响[9]，病原体核酸检测也可能存在假阴性的错误结果发生，对于和临床症状不符、临床高度怀疑感染的患者，可二次送检。实验室在尽可能抓好检验前质量，提高核酸检测准确性的同时，临床应结合实验室其他检测手段，影像学检查结果及患者的实际情况综合分析，从而降低误诊率、漏诊率。

本文所使用的多重实时荧光定量PCR检测体系，引物由湖南圣湘生物科技有限公司提供，确保了引物的准确性。操作者是持有PCR上岗证书且有多年的PCR工作经验，保证了试验操作的准确性。此方法能够用一份标本在3～4 h内同时检测13种常见呼吸道感染的病原体。与细菌培养、血清学抗体、单靶标PCR方法等现阶段实验室用于检测呼吸道病原体的手段相比，多重实时荧光PCR技术的检测试剂盒因为其本身的方法学特点，操作较为简便，在缩短检测周期的同时，受外界干扰因素较小，病原体检出率较传统方法有较大的提高，为呼吸道感染疾病的病原体确定提供可靠的实验室依据。

综上所述，运用实时荧光多重PCR技术能够在实验室角度为临床医生提供呼吸道感染病原体的感染证据，辅助临床诊断，促进合理正确用药。

参考文献

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[5]    KUMAR SURINDER.Mycoplasma pneumoniae：A significant but underrated pathogen in paediatric community-acquired lower respiratory tract infections[J].The Indian Journal of Medical ResearchVolume，2018，147（1）：23-31.

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[7]    龙鑫，石珮入，罗征秀，等.上呼吸道肺炎链球菌定植对呼吸道合胞病毒感染患儿临床表现的影响[J].中华儿科杂志，2022，60（7）：694-699.

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[9]    王博文，李国凯，杨莉，等.不同样本保存条件对鼻咽拭子呼吸道病原体核酸检测的影响[J].临床检验杂志，2021，39（11）：836-838.（收稿日期：2023-02-03）