ADAM9和p53在卵巢癌中的表达及其临床意义

徐 捷，林 梅，袁冬兰，徐德昊，郭 婷

（南京医科大学附属泰州人民医院，江苏 泰州 225300）

卵巢癌是世界范围内最常见的妇科肿瘤之一。在目前的临床工作中，与许多其他类型的肿瘤一样，卵巢癌缺乏早期症状，大多数患者在确诊时，肿瘤已处于晚期，预后差，导致卵巢癌女性的生存率很低。既往报道，如果早期发现，卵巢癌患者存活率可达70%～90%[1]，所以探究早期诊断和预后的生物标志物对于提高卵巢癌女性的治疗疗效和生存率具有重要意义。

肿瘤的发生和进展是一个涉及多种原癌基因激活和抑癌基因失活的渐进过程。p53基因是目前研究最广泛的一种与人类肿瘤相关的抑癌基因，其突变后会促进肿瘤的发生发展，通过诱导细胞程序性重排和分化，促进肿瘤形成[2]。所以，抑癌基因p53 基因失活在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。ADAM 蛋白家族是一组包含金属蛋白酶域的跨膜蛋白，负责释放细胞表面蛋白，如生长因子、细胞因子或受体。有研究表明ADAM 家族蛋白的异常表达与不同类型肿瘤的发生发展密切相关[3]。ADAM 家族的成员ADAM9 在卵巢癌中高表达，但其潜在机制尚不清楚，其作用和功能的研究还有待进一步探索。本研究旨在探讨ADAM9和抑癌基因p53 在卵巢癌患者诊断及预后中的价值，以期为卵巢癌患者临床诊断的治疗方案及预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料选取2016 年01 月至2022 年12 月间泰州市人民医院收治的128 例卵巢癌患者和配对相邻的癌旁组织，所有组织标本均置于-80℃冰箱中保存。本研究已获得泰州市伦理委员会批准并在每位患者的知情同意书上签字。

纳入标准：（1）均经病理诊断符合中国抗癌协会卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南（第四版）中卵巢癌诊断标准[4]；（2）患者为首次发病；（3）均签署知情同意书。

排除标准：（1）肿瘤复发转移或合并其他恶性肿瘤者；（2）术前接受化疗或放疗的患者；（3）有其他严重疾病者如严重血液系统疾病；（4）严重肝肾功能不全或重度感染等。

1.2 仪器与试剂RNA 提取TRIzol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司，RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR（RT-PCR）试剂盒购自美国TakaRa 公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，ADAM9抗体和p53（野生型）抗体购自美国Boster公司，PCR 反应仪器ABI 7500 实时荧光定量PCR仪系统购自美国应用生物系统公司，免疫组化试剂盒购自美国Maxim公司。

1.3 实验方法按照TRIzol试剂盒进行总RNA提取。按照RNA 逆转录试剂盒说明书合成cDNA，置于-20℃冰箱中保存。RT-PCR 检测ADAM9 和p53的表达，建立RT-PCR扩增反应体系，扩增反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，共计40个循环。

表1 ADAM9、p53及内参GAPDH引物序列表

石蜡包埋卵巢肿瘤组织及邻近正常组织，切片4μm，用蛋白质阻断溶液热固定，与ADAM9抗体（1:1000 稀释）或p53 抗体（1:1000 稀释）孵育，然后用含有HRP 标记的抗兔二抗（1:1000 稀释）处理，最后用二氨基联苯胺（DAB）染色组织样本并进行显微成像拍摄。

1.4 组织学评分免疫组化样本的评分由两位经验丰富的医生独立确定。组织学评分：将染色强度分为0（-）、1（弱）、2（中）、3（强）；将阳性区域分为0（阳性区域<10%）、1（阳性区域10%～25%）、2（正区25%～50%），3（正区>50%）。然后将染色强度与阳性区域相乘计算每个样本的评分，ADAM9（0～3 为低表达，4～9 为高表达），p53（0～3为低表达，4～9为高表达）。

1.5 统计学处理统计学采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组样本采用配对t检验进行分析，比较采用卡方检验。相关性及生存分析曲线根据Kaplan-Meier Plotter 数据库（https://kmplot.com/analysis/）数据绘制，采用Pearson检验分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 在卵巢组织中ADAM9 和p53 的表达根据ADAM9 和p53 在卵巢癌及癌旁组织中表达的免疫组织化学结果和组织学评分比较，我们发现在卵巢组织中，肿瘤组织的ADAM9高表达率显著高于癌旁组织，表达差异具有统计学意义（P<0.05）；肿瘤组织的p53 高表达率显著低于癌旁组织，表达差异具有统计学意义（P<0.01）。见图1，表2。

图1 ADAM9和p53在卵巢癌及癌旁组织中表达的免疫组织化学分析

表2 ADAM9和p53在卵巢癌及癌旁组织中的表达

2.2 卵巢癌患者临床特征比较卵巢肿瘤组织中，卵巢癌I/II期ADAM9高表达率54.12%，III/IV期ADAM9 高表达率67.44%；肿瘤未转移ADAM9高表达率45.76%，肿瘤已转移ADAM9 高表达率68.12%，结果显示ADAM9的表达与肿瘤是否转移相关，其表达具有显著性差异（P<0.05）。

卵巢肿瘤组织中，卵巢癌I/II 期p53高表达率58.82%，III/IV期p53高表达率37.21%，结果显示p53 的表达与肿瘤FIGO 分期相关，其表达具有显著性差异（P<0.05）；肿瘤未转移p53 高表达率69.49%，肿瘤已转移p53 高表达率43.48%，结果显示p53 的表达与肿瘤是否转移相关，其表达具有显著性差异（P<0.01）。详见表3。

表3 ADAM9和p53的表达与卵巢癌患者临床病理特征的关系

2.3 卵巢癌患者ADAM9 和p53 的表达分析采用RT-PCR 的方法比较了30 例卵巢肿瘤标本与癌旁组织中ADAM9和p53的表达，发现卵巢肿瘤组织中ADAM9的表达明显高于癌旁组织（P<0.01），p53的表达明显低于癌旁组织（P<0.01）。见图2。

图2 ADAM9和p53在卵巢肿瘤组织和癌旁组织中mRNA的表达

ROC分析结果显示，对于卵巢肿瘤组织ADAM9的AUC 为0.924，95%置信区间（CI）为0.880 ～0.967；p53 的AUC 为0.851，95%置信区间（CI）为0.796～0.906；表示ADAM9 和p53 是诊断卵巢癌的敏感标志物。见表4。

表4 ADAM9和p53的ROC曲线分析

2.4 ADAM9 和p53 在卵巢肿瘤组织中表达的相关性我们根据Kaplan-Meier Plotter数据库（http://kmplot.com/analysis/）中卵巢癌组织ADAM9 和P53 的表达，绘制了ADAM9 和p53 的相关性分析图，采用Pearson检验得出ADAM9和p53呈负相关（r=-0.123，P<0.0001）。见图3。

图3 ADAM9和p53在卵巢肿瘤组织中相关性分析

2.5 ADAM9 和p53 对卵巢癌患者预后的影响使用Kaplan-Meier绘图仪（http://kmplot.com/analysis/）分析ADAM9和p53在卵巢癌患者中的预后价值。如图4 所示，首先分析了ADAM9 的mRNA 表达水平与卵巢癌患者预后的关系，结果表明ADAM9 低表达卵巢癌患者的总生存期（Overall survival，OS）（P<0.05） 及无病进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）（P<0.01） 均显著高于ADAM9高表达的卵巢癌患者。

图4 比较ADAM9高表达和低表达的卵巢癌患者总生存期和无病进展生存期

接着分析了p53的表达与卵巢癌患者预后的关系，结果如图5所示，p53 mRNA表达水平虽然对卵巢癌患者的总生存期（Overall survival，OS）无显著影响，但p53 mRNA高表达卵巢癌患者无病进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）显著高于p53 mRNA低表达卵巢癌患者（P<0.001）。

图5 比较p53高表达和低表达的卵巢癌患者总生存期和无病进展生存期

3 讨论

在妇科肿瘤中，卵巢癌是导致死亡的首要原因，其发病率呈逐年升高，并有年轻化趋势。因为其临床缺乏特异性的早期症状和早期诊断方法，通常在晚期确诊。所以，寻找早期诊断及预后标志物，对提高患者早期诊断及生存率具有重要意义。

ADAM9是一种膜锚定蛋白，涉及细胞与细胞以及细胞与基质的相互作用，包括肿瘤的发生过程，其在多种类型癌症中具有重要作用。Oria 等发现ADAM9可能参与了胰腺导管腺癌的发生和发展[5]；ADAM9 在胃癌发生过程中通过调节胃癌细胞的增殖，起到肿瘤启动子的作用，受到micoRNA-126 负调控[6]。Ueno 等报道了ADAM9 在卵巢癌中过表达，可能导致了卵巢肿瘤细胞对顺铂的敏感性[7]，本研究中，我们观察到肿瘤组织中ADAM9在卵巢肿瘤组织中表达明显升高，与Ueno等的观察一致。此外，通过研究ADAM9的表达和临床信息的相关性，发现卵巢癌III/IV 期患者ADAM9 高表达率较I/II 期患者高，肿瘤已转移的患者ADAM9高表达率较未转移患者高；ROC分析证实ADAM9可以区分卵巢肿瘤组织与相邻非肿瘤组织，生存曲线分析结果表明ADAM9与卵巢癌患者的预后显著相关。由此可见，ADAM9在卵巢肿瘤组织中表达升高，并可能作为卵巢癌诊断的潜在标志物。

p53 基因是人类癌症中最重要的肿瘤抑制因子，能保持基因组的完整性和稳定性，调节细胞周期凋亡和促进DNA修复[8]。p53可分为野生型和突变型，野生型p53有肿瘤抑制作用，突变的p53会影响蛋白的稳定性，以及抑制细胞的增殖作用，使肿瘤更易发生侵袭和转移。Gudkov 等发现野生型p53 有促进免疫方面的内在作用，在癌症发展中对慢性炎症有积极影响[9]。本研究中，我们发现肿瘤组织中p53（野生型）的表达较癌旁组织明显降低。此外，通过研究p53 的表达和临床信息的相关性，发现卵巢癌III/IV期患者p53的表达较I/II期患者明显降低；同时p53 的表达与肿瘤FIGO 分期（P<0.05）和肿瘤是否转移（P<0.01）显著相关。ROC 分析证实p53 可以区分卵巢癌肿瘤组织与相邻非肿瘤组织，生存曲线表明p53 与卵巢癌患者的预后显著相关。综上所述，p53在卵巢肿瘤组织中表达降低，可能作为卵巢肿瘤诊断的潜在标志物。

有研究表明ADAM9可能作为不同疾病的预后标志物，Fan 等人发现ADAM9 可能作为低级别胶质瘤的预后标志物[10]，Kossmann 等认为在肺腺癌中ADAM9 的高表达可能预示预后不良[11]。p53 基因的表达水平升高与胃癌的转移、浸润和预后均密切相关，提示肿瘤有较高的深部浸润倾向和淋巴结转移能力，从而可导致胃癌患者预后不良[12]。在本研究中，我们发现在卵巢肿瘤组织中，ADAM9 和p53 具有显著负相关性（r=-0.123，P<0.001）；并且ADAM9高表达组OS和PFS均明显降低，p53 低表达组PFS 明显降低，通过ROC 曲线分析显示了ADAM9高表达和p53低表达在卵巢癌患者预后评估中的价值。这些结果提示ADAM9和p53可能联合作为卵巢肿瘤的预后标志物，并可能有利于疾病的治疗。

综上所述，我们的结果表明卵巢肿瘤的发生发展及浸润转移与ADAM9高表达和p53的低表达显著相关；并发现ADAM9和p53的检测与临床病理指标和生存预后的关系密切，ADAM9 和p53 在卵巢肿瘤组织中显著负相关，可作为卵巢肿瘤的潜在诊断和预后的标志物，对卵巢癌患者临床早期诊断和治疗具有积极意义。