QuEChERS结合LC-MS/MS法测定灯盏花中农药残留*

杨光梅，黄 燕，卢 琦，李杰丽，任云伟，魏 波，范银英，李浩成，郭利娟

(1.云南现代民族药工程技术研究中心，云南 昆明 650217；2.国家中药现代化工程技术研究中心 民族药分中心，云南 昆明 650217；3.昆明理工大学附属医院 云南省第一人民医院MICU科，云南 昆明 650032)

灯盏花主产于云南，是短葶飞蓬(菊科植物)Erigeron breviscapus (Vant.)Hand-Mazz的干燥全草，是比较常用的中药材，又称为灯盏细辛、东菊、地顶草等[1]。主要的有效成分为灯盏乙素和野黄芩苷，具有发表散寒、消炎、止痛之功效。是灯盏细辛颗粒、灯盏细辛口服液、灯盏花注射液和注射用灯盏花素等制剂主要原材料[2]。种植期间会受到病虫害的影响，主要害虫是蜗牛、蚜虫、菜青虫、地老虎。灯盏花在投料使用前虽然经过了适当的晾晒、干燥等处理，但作为全草药材直接投入使用，非常有必要对其所含的农药残留成分，尤其是国家农业部及相关部门已明令禁止使用的高毒、剧毒、高残留、致癌、致畸、致突变的农药组分及《中国药典》2020版四部农药残留的规定进行控制和考察，保证患者用药安全，建立适用于灯盏花药材的农药残留测定方法[3]。近年来，QuEChERs 发展较快已成为国际上广泛并得认可的一种用于中药材、农副产品等残留检测的快速样品前处理技术.[4-7]本法有高效、快速、简单、科学等特点，在农药残留检测中得到普遍广泛应用[8]。本实验采用QuEChERs-超高效液相色谱-串联质谱法测定中药灯盏花29种禁用农药残留。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

超高效液相色谱-串联质谱联用仪 (Agilengt 1290 infinity-6470 LC/MS美国安捷伦公司)；电子天平 (SI-224赛多利斯科学仪器有限公司)；分液漏斗震荡器(MMW东京理化器械株式会社)；多功能冷冻离心机 (Rotina 380R上海凌仪生物科技有限公司)；震荡器 (VORTEX 海门市其林贝尔仪器制远有限公司)。

1.1.2 试剂

乙腈 (GR，赛默飞世尔科技)、甲酸胺 (GR，天津市风船化学试剂科技开发有限公司)、磷酸、冰醋酸 (AR，国药集团试剂有限公司)、QuEChERs SPE净化管 (批号：6559539-01，北京迪马科技公司)。

1.1.3 对照品

禁用农药混合对照溶液(批号：610020-202001，中国食品药品检定研究院)

1.1.4 样品

所用15批灯盏花药材经鉴定均为正品，灯盏花：(批号：210701、220101昆明道地中药饮片厂；批号：190103 云南金发药业有限公司；批号：200526 云南展熠药业有限公司；批号：210226、210510、210526 昆明市官渡区肖友明中药材经营部；批号：211201、 211202、211203、211204、220301、220302、220303、22030昆明广有堂中药材经营部)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 色谱柱

Infinity Poroshell 120 EC-C18 (3.0 mm ×100 mm，2.1 μm)

2.1.2 流动相

A：0.1%甲酸溶液 (含5 mmoL甲酸铵)

B：乙腈-0.1%甲酸水溶液 (含5 mmoL甲酸铵)(95∶5)并按表.进行梯度洗脱：

表1 梯度洗脱表

2.1.3 流动相

色谱柱柱温：40 ℃，流速：0.3 mL/min

2.1.4 进样量

供试品溶液和对照品溶液：2 μL

2.1.5 质谱检测器

干燥气 (N2)流速：11.0 L/min；雾化气 (N2)压力：40 psi；干燥气温度：250 ℃；毛细管出口电压：3500 V；靶气流速：11.0 L/min；靶气温度：350 ℃；喷嘴电压：0 V。

2.1.6 检测模式

多反应监测 (MRM)模式

2.2 对照品溶液的配制

精密量取对照品 0.5 mL 置于 10 mL 容量瓶中，加色谱级乙腈稀释至刻度，混匀，获得对照品储备液。

2.3 基质溶液制备

取灯盏花空白基质样品，同2.5供试品溶液制备方法制成溶液作为空白基质。

2.4 标准工作溶液的制备

精密量取对照品储备溶液 10 μL 并加入空白基质 600 μL 混匀，即质量浓度约为 5 ng/mL 的混合标准溶液。精密吸取上述混合标准溶液 20 μL，精密加入空白基质 600 μL，混匀，即得质量浓度约为 1000 ng/mL 的混合标准溶液，用相同的方式依次稀释分别得到质量浓度约为10、20、40、60、80、100、200 ng/mL 的混合标准工作溶液。

2.5 供试品溶液配制

取不同批次来源的供试品，粉碎，粉末 (并过三号筛)，精密称定 3 g，放置于聚苯乙烯具塞离心管中，加入 15 mL 1%冰醋酸溶液，在涡旋仪上混匀让药粉充分浸润，放置 30 min 以上，精密加入 15 mL 色谱乙腈与内标溶液 100 μL，混匀，置振荡器上剧烈震荡(500次/min)10 min 以上，加入质量比例为 (1∶4)无水乙酸钠与无水硫酸镁的混合粉末 7.5 g，及时摇散，再置振荡器上剧烈振荡(500次/min)10 min 左右，于冰浴中冷却 10 min，离心 (3500转/min)5 min。取上清液 9 mL，置已预先装有净化材料的分散固相萃取净化管[N-丙基乙二胺(PSA)300 mg，无水硫酸镁 900 mg，十八烷基硅烷键合硅胶 300 mg，石墨化炭黑 90 mg，硅胶 300 mg]中，使物料充分混匀，再置振荡器上剧烈震荡(600次/min)10 min 使净化完全，离心 (4500转/min)10 min，吸取上清液，用微孔滤膜 (0.22 μm)滤过，作为供试品溶液 。

分别取对照品溶液、供试品溶液、空白基质溶液 2 μL 进样，图谱如下图1、图2、图3。

图1 对照品谱图

图2 样品谱图

图3 空白基质谱图

2.6 检出限、定量限、线性关系与线性范围考察

分别精密吸取上述2.4制备好的禁用农残对照品溶液 2 μL 注入液相色谱仪按上述色谱条件测得峰面积，以峰面积积分值进行回归处理。结果见表2。

表2 LC-MS/MS各分析物的检测结果

2.7 系统精密度、准确度(加标回收率)

参照对照品溶液配制与供试品溶液配制方法，配制约 50 ng/mL 对照品溶液1份，对照品溶液连续进样6针，分别记录29项禁用农药的保留时间与峰面积。可接受标准：各峰的保留时间RSD≤2%(n=6)，各峰的峰面积RSD≤15%(n=6)。

采用全程加标法，即取约 3.0 g 灯盏花药材粉末，精密称定，加入农药残留对照品储备液0.75、1.5、2.25 mL 各3份，对照品的加入量为与所取供试品中待测定成分量之比控制在1∶0.5、1∶1、1∶1.5左右，之后按照供试品溶液制备方法配制。按50%，100%，150%质量分数分别配制9份供试品加标溶液。对照品、供试品溶液各进样1次，对照品溶液、供试品溶液分别进样 2 μL，结果见表3。

表3 系统精密度、回收率结果

2.8 样品定性、定量测定

2.8.1 定性测定

进行样品定性分析测定时，如果检出的色谱峰与对照品的保留时间一致，在扣除背景后的质谱图中，被选择的2个监测离子对都同时出现，而且所选择的监测离子对与对照品的监测离子对峰面积比一致(相对比例大于50%，允许偏差±20%：相对比例大于20%～50%，允许偏差±25%：相对比例大于10%～20%，允许偏差±30%；相对比例小于10%，允许偏差±50%)，则可判断样品中存在该农药。

2.8.2 定量测定

取上述制备好的对照品溶液和供试品溶液各2μL注入，计算各分析物含量。结果：15批灯盏花药材中均未检查出29种分析物。

3 讨论

样品取样量的确定—灯盏花药材经加工处理后为干燥药材，含水量不多。3 g的样品量比较方便合适，且具有一定的代表性。不会因取样量过大，而导致试剂、样品的浪费及环境的污染。最后处理得到供试品溶液中药材含量为0.5 g/mL，满足药材痕量分析要求。

提取后的灯盏花溶液含有植物甾醇、树胶、树脂、鞣质、挥发油等物质，参考文献相关报道，快速样品处理法 (QuEChERS)相对直接提取法能更好地去除杂质、防止被测组分和回收率的流失、保证试验的准确性。

离子对的优化与判断标准根据全扫描质谱得到标准农药的各保留时间划分时间段，尽可能减少在每一时间段所检测目标化合物的数量。在质谱图中，选择3对特征离子，丰度较高的一对作为定量离子对，其余两对为定性离子对。采用保留时间和离子丰度比定性，再用定量离子对的峰面积定量.

参照《中国药典》2020年版四部通则2341农药残留测定法第五法：高效液相色谱-串联质谱法对15批灯盏花进行农药残留量的测定，其标准限度按 《中国药典》2020年版四部通则0212药材和饮片检定通则项下33种禁用农药不得检出 表执行，其中高效液相色谱-串联质谱法收载30种农药测定，但气相色谱-串联质谱法也有部分项目重复检测，考虑分析物甲基异柳磷在气相色谱-串联质谱法检测效果较佳，所以不在重复进行测定只测定上述29项结果均为未检出。根据上述探索性研究结果表明，该方法基本可适用于灯盏花禁用农药残留的质量控制。

4 结论

本研究建立了灯盏花药材中禁用农药残留量测定法。对不同来源、方法适用性、分析物含量等方面进行了考察研究，发现能按此超高效液相色谱-串联质谱法对灯盏花药材进行29种禁用农药残留测定，此方法能准确、快速、科学、有效地控制产品质量。确定取样量为3 g，采用快速样品处理法 (QuEChERS)处理，按超高效液相色谱-串联质谱法为灯盏花29种禁用农药残留测定法。