灯盏花素通过调节PDK1表达调控结直肠癌进展的机制研究*

杨 宁，王 瑶，武明爽，郝 玲，王 雷

1.哈尔滨医科大学附属第四医院松北肿瘤内科，黑龙江 哈尔滨 150028；

2.哈尔滨医科大学附属第四医院肿瘤内科，黑龙江 哈尔滨 150000

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是全球常见的恶性肿瘤，据统计2018 年全球新发结直肠癌180 多万例，死亡88.1万例［1］，世界范围内结直肠癌症发病率位于第三位，死亡率位于第二位。我国所处的亚洲也是结直肠癌发病率较高的地区之一。虽然外科手术、化疗、靶向治疗等治疗手段的运用延长了患者的生存时间，但结直肠癌复发转移以及因此带来的癌症相关死亡风险仍然居高不下。

作为中华民族瑰宝的祖国传统医药，近年来越来越多的在临床恶性肿瘤的治疗中发挥出其天然优势。灯盏花素是从中药半枝莲、灯盏花等植物的茎叶中提取的活性单体成分，具有抗氧化、清除自由基、抗炎性反应等特性。近年来随着灯盏花素药理作用相关研究的逐渐完善，其抗肿瘤特性渐渐显露出来。多项研究相继发现灯盏花素在乳腺癌［2］、淋巴瘤［3］、舌鳞状细胞癌［4］、结直肠癌［5］和前列腺癌［6］等多种肿瘤中均具有抗肿瘤效应，主要表现在抑制肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡以及抑制肿瘤血管生成。但对于灯盏花素在结直肠癌中的确切作用机制尚无定论。本研究通过灯盏花素对结直肠癌作用及相关机制的研究，为结直肠癌寻找新的治疗靶点和方向。

1 材料与方法

1.1 一般资料

HCT-116 结直肠癌细胞系（中国科学院细胞库）。NCM460 正常结肠上皮细胞系（美国典型培养物保藏中心）。灯盏花素购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要试剂与仪器

垂直电泳仪（美国BIO-RAD 公司），DYY-122型电泳仪（北京六一仪表厂），PCR 仪（美国Eppendorf 公司），紫外凝胶检测成像系统（美国CapitalBio 公司）。AO/EB 试剂盒（美国Invitrogen 公司），MTT（美国Sigma-Aldrich 公司），Hoechst 33342试剂盒（美国Invitrogen公司）。

1.3 主要方法

1.3.1 细胞培养、传代 HCT-116 结直肠癌细胞及NCM460 正常结肠上皮细胞在含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素及50 μg/mL链霉素的DMEM培养基中培养，培养瓶置于37 ℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度环境的培养箱中，每两天更换一次培养基。当细胞生长至80%～90%融合时开始进行传代，加入0.25%的胰蛋白酶消化液2 mL，常温消化3 min，当大部分贴壁细胞消化释放变圆时终止消化，用吸管反复吹打形成细胞悬液，分瓶培养。

1.3.2 MTT法检测HCT-116细胞增殖能力 设置灯盏花素处理组和对照组，选择对数生长期的细胞接种到96 孔板（104个细胞/孔），灯盏花素处理组分别以a、b两种给药方式作用。a 方式：灯盏花素处理每孔分别加入浓度为10、30、100 μmol/L 灯盏花素溶液100 uL，空白对照组加入等量DMSO，作用48 h，倒置显微镜观察。b 方式：灯盏花素处理组每孔细胞分别加入浓度为30 μmol/L 灯盏花素溶液100 uL，空白对照组加入等量100 uL 的DMSO，分别作用24、48、72 h，倒置显微镜观察。其后每孔加入新鲜配制的MTT 溶液（浓度为5 mg/mL）20 uL，于37 ℃培养箱中继续孵育4 h，终止培养，悬浮细胞离心后每孔分别加入DMSO 100 uL，低速振荡使蓝色结晶物充分融解。在酶联免疫检测仪上测定各孔在540 nm 处吸光值，记录结果。分别以药物浓度和细胞培养时间作为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制曲线。以上实验需重复3次。

1.3.3 Hoechst 33342 细胞凋亡检测 参照Invitrogen 公司Hoechst 33342 染色试剂盒说明书操作。将密度为106个细胞/mL 的HCT-116 细胞接种到96 孔板，共分4 组（3 个实验组，1 个对照组），每组设置3 个重复孔，各实验组分别加入浓度为10、30、100 μmol/L 的灯盏花素溶液100 uL，空白组加入等量DMSO，置入37 ℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度环境的培养箱，孵育48 h。小心吸去孔内上清液，PBS 清洗1 次，室温下4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗一次，加入浓度为20 μg/mL 的Hoechst 33342 工作液100 uL，室温15 min，吸出荧光染料，倒置荧光显微镜观察凋亡细胞形态并拍照。在荧光显微镜下观察分析：活细胞，细胞核呈均匀一致的蓝色；凋亡细胞，细胞核呈亮蓝色，且伴有核固缩。以上实验需重复3次。

1.3.4 AO/EB双染色法细胞凋亡检测 参照Invitrogen公司AO/EB 双染色试剂盒说明书操作。将密度为106/mL 的HCT-116 细胞，接种至96 孔板，每孔体积100 uL，共分4组（3 个实验组，1 个对照组），每组设置3 个重复孔，各实验组细胞分别加入浓度为10、30、100 μmol/L 的灯盏花素溶液100 μL，空白组加入等量DMSO，孵育48 h。随后各加10 μL AO/EB 工作液，室温下作用5 min，取上述染色液一滴，滴在洁净的载玻片上，加上盖玻片后立即在倒置荧光显微镜下观察镜下细胞变化和凋亡小体。AO 能透过胞膜完整的细胞，嵌入胞核DNA，使之发出绿色荧光。EB 仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入胞核DNA，发橘红色荧光。在荧光显微镜下观察分析：活细胞，核染色质呈绿色；凋亡细胞，核染色质呈橘红色，固缩状或圆珠状。以上实验需重复3次。

1.3.5 TUNEL 染色法细胞凋亡检测 参照Roche 公司TUNEL染色试剂盒说明书操作。HCT-116细胞爬片，贴壁后分别加入浓度为10、30、100 μmol/L 的灯盏花素溶液，空白组加入等量DMSO，作用4 h，PBS 清洗3 次，室温下4%多聚甲醛固定1 h，于冰上用0.1% TritonX-100 溶于0.1%柠檬酸钠溶液通透2 min，PBS清洗2次，各孔分别加入50 μL TUNEL 反应混合溶液，在37℃湿盒中避光孵育1 h，PBS 清洗3 次，随后加入转化剂-POD 50 μL，于37 ℃湿盒中继续孵育30 min，PBS 清洗3 次，载玻片上滴加100 μL DAB 底物溶液，室温孵育5～10 min，随时进行镜下观察，待染色后立刻用蒸馏水终止反应，蒸馏水冲洗2 次，苏木素复染，自来水冲洗2 min，80%～100%梯度乙醇脱水，各3 min，二甲苯透明，各5 min，封片。荧光显微镜下观察分析：活细胞核呈蓝色；凋亡细胞核呈棕褐色，固缩状或圆珠状。以上实验需重复3次。

1.3.6 Western blot 检测PDK1 蛋白表达 浓度为10、30、100 μmol/L 的灯盏花素溶液处理后的HCT-116细胞、空白对照组HCT-116 细胞及NCM460 正常结肠上皮细胞，分别在37 ℃、5% CO2、95%空气、饱和湿度环境的培养箱，孵育48 h，收集各组细胞。经预冷的PBS 漂洗3次，每孔加入100 μL 富含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA 裂解液，5 min 后在4℃条件下14 000 r/min 离心10 min，取上清，使用Bradford 蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白质定量。经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜以及含有5%脱脂奶粉的磷酸缓冲液室温封闭1 h，加入5%脱脂奶粉稀释的兔抗PDK1 单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。次日洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的IgG 羊抗兔二抗，室温孵育2 h。放入显像液中1 min显像，暗室曝光。随后采用LI-COR DNA 分析系统和Odyssey v1.2 软件定量分析条带的灰度，以灰度值作为参照，计算蛋白表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灯盏花素对HCT-116结直肠癌细胞增殖能力的影响

分别以10、30、100 μmol/L 不同浓度的灯盏花素溶液作用于HCT-116 细胞，在酶联免疫监测仪上测定各孔在540 nm 处吸光值，记录结果。分别以药物浓度和细胞培养时间作为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制曲线。MTT实验结果显示：10 μmol/L 浓度组、30 μmol/L 浓度组以及100 μmol/L 浓度组与空白对照组相比，各实验组均能够抑制HCT-116 细胞增殖，且对HCT-116 细胞增殖的抑制程度与作用药物的浓度具有相关性，随着药物浓度逐渐增加，存活细胞数目逐渐减少，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。不同浓度的灯盏花素通过剂量—依赖方式抑制结肠癌HCT-116细胞生长。

图1 灯盏花素对HCT-116细胞增殖的影响

以浓度为30 μmol/L 的灯盏花素溶液分别作用于HCT-116 细胞不同时间（24 h、48 h、72 h），结果显示：24 h组、48 h 组、72 h 组与空白对照组相比，随着药物作用时间的逐渐增加，存活细胞数目逐渐减少，对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B。相同浓度的灯盏花素通过时间—依赖方式抑制结肠癌HCT-116细胞生长。

2.2 Hoechst 33342染色法检测HCT-116细胞凋亡作用

采用Hoechst 33342 染色法评价不同浓度的灯盏花素对HCT-116 细胞凋亡诱导作用。分别用10、30 以及100 μmol/L 不同浓度的灯盏花素溶液作用于HCT-116细胞相同时间，结果显示：灯盏花素作用后10 μmol/L 浓度组、30 μmol/L 浓度组、100 μmol/L 浓度组细胞分别出现呈亮蓝色细胞核的阳性细胞，且伴有染色质凝聚、核固缩等形态改变。并随给药浓度增大，阳性细胞增多，凋亡率增加。空白对照组细胞核为均匀一致的蓝色，未出现上述异常表现的阳性细胞，见图2A。

图2 灯盏花素诱导HCT-116细胞凋亡

2.3 AO/EB双染色法检测HCT-116细胞凋亡作用

采用AO/EB 双染色评价不同浓度灯盏花素对HCT-116细胞凋亡诱导作用。分别用10、30、100 μmol/L 不同浓度的灯盏花素溶液作用于HCT-116 细胞相同时间，结果显示：灯盏花素作用后10 μmol/L 浓度组、30 μmol/L 浓度组、100 μmol/L 浓度组细胞分别出现呈橘红色细胞核的阳性细胞，且伴有染色质凝聚、核固缩等形态改变。并随药物浓度增大，阳性细胞增多，凋亡率增加。空白对照组细胞核为均匀一致的绿色，未出现上述异常表现的阳性细胞，见图2B。

2.4 TUNEL染色法检测HCT-116细胞凋亡作用

采用TUNEL 染色法检测细胞凋亡，凋亡细胞为阳性细胞，镜下显示为细胞核呈棕色。非凋亡细胞为阴性细胞，镜下显示为细胞核呈蓝色。结果显示：不同浓度的灯盏花素作用后的各实验组细胞均出现细胞核呈棕色的阳性细胞，且伴有染色质凝聚、核固缩等形态改变。随药物浓度增大，阳性细胞增多，凋亡率增加。空白对照组几乎无TUNEL检测阳性细胞，见图2C。

2.5 PDK1在结肠癌细胞中的表达上调

通过Western blot 检测结直肠癌HCT-116 细胞和正常结肠上皮NCM460 细胞中丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）蛋白表达情况，结果显示：HCT-116 细胞中PDK1 蛋白表达相较于对照细胞显著升高，见图3。

图3 Western blot检测PDK1蛋白表达

2.6 灯盏花素抑制PDK1表达

不同浓度10、30、100 μmol/L 的灯盏花素作用于HCT-116 细胞48 h 后，通过Western blot 法检测作用前后细胞内PDK1 表达的情况。结果显示：与对照组相比，各实验组细胞PDK1 蛋白表达量均减少，且蛋白表达量随药物浓度增加而下降；其中30 μmol/L 药物作用实验组和100 μmol/L 药物作用实验组与空白对照组相比具有显著性差异（*P＜0.05 vs 对照组），10 μmol/L 药物作用实验组与空白对照组相比没有显著性差异，见图4。

图4 Western blot检测灯盏花素作用后的HCT-116细胞PDK1蛋白表达

3 讨论

结肠癌是人类第三大常见的恶性肿瘤，每年全世界有近14 900 例确诊患者［7-8］。近年来，结肠癌患病率具有逐年增加的趋势。当前，结肠癌的治疗是以手术结合术后辅助化疗为主的综合性治疗［9］。但是，由于结肠癌细胞对大多数化疗药物存在耐药情况，所有这些治疗方法很难控制肿瘤不出现复发或转移等疾病进展［10］。因此亟待对治疗结肠癌新的有效抗肿瘤药物进行开发和研究。

灯盏花素是一种从中草药半枝莲中提取出的主要活性化合物，并已经应用了上百年［11-12］。有报道显示，灯盏花素具有多种生物学活性，如抗氧化、抗炎、抗细菌等作用，因此被临床用来治疗冠状动脉疾病、脑血栓形成、脑梗死和高血压病等［13-14］。近年来，有报道显示，灯盏花素能够诱导结肠癌、恶性淋巴瘤和舌癌细胞凋亡，并有一定应用于临床的潜在可能［14］。例如，灯盏花素能够通过线粒体通路途径抑制白血病U937 细胞生长并诱导其细胞凋亡［15］。灯盏花素能够通过增强Caspase-6 活化从而有效的致敏药物诱导的结肠癌细胞凋亡［14］。体内研究也同样证明了灯盏花素在舌癌中能够通过降低MMP-2 和MMP-9 的表达，显著减缓肿瘤生长，抑制肿瘤新生血管生成，并导致肿瘤细胞凋亡［16-17］。

本实验研究结果发现，灯盏花素能够以时间—依赖和计量—依赖两种方式显著性抑制结肠癌HCT-116 细胞增殖，同时具有促进细胞凋亡的双重作用。且这种抑制肿瘤细胞生长的作用甚至在较低浓度（10 μmol/L）时仍然存在。然而其确切的作用机制尚不清楚。

PDK1 由63kDa 的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）组成，作为AGC激酶家族的一员，是一种重要的蛋白激酶，同时也是AKT 上游的激活剂。PDK1 的结构主要包括两部分：N末端的激酶结构域及C 末端的血小板—白细胞C 激酶底物同源性结构域（PH domain），通过其在细胞外的受体激活传导如细胞内部并进行接下来的信号转导过程［18-19］。其下游PI3K/AKT/mTOR 信号通路与结直肠癌的发生发展存在密切联系，通路中多种生长因子与受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTK） 相结合后进一步激活PI3K，使二磷酸肌醇（PIP2）转化为三磷酸肌醇（PIP3）。PIP3 与AKT 和PDK1 的PH 域结合，随后PDKl 可通过激活AKT 蛋白的第308 位点的苏氨酸发生磷酸化从而活化［20-21］。活化后的AKT 可进一步激活下游的一系列底物，如mTOR/p70-S6K、Bad和Bax等，进而影响并调节癌细胞的生长、存活、糖代谢以及细胞迁移和凋亡等多种生物学进程［22-24］。PDK1 是一种强效蛋白激酶，通常与癌症中的信号级联改变有关，如PI3K/Akt 信号和Ras/MAPK 信号［22-24］。PDK1的高表达或过度激活能够导致PI3K/AKT 信号通路的激活，或AKT 非依赖性mTOR 信号通路的激活，进而促进癌症进展［22-24］。

本研究结果证实了HCT-116 细胞中PDK1 呈高表达，而灯盏花素确作用后能够使PDK1 的表达量显著下降。综上所述，灯盏花素是通过抑制结直肠癌细胞中PDK1 的表达发挥抑制HCT-116细胞增殖并促进细胞凋亡作用，为结直肠癌体外基础研究提供了新的方向。