外周血T淋巴细胞亚群的表达变化与急性髓系白血病患者复发风险的关系

牛静静，薛 燕，杨 洁

三门峡市中心医院检验科，河南 三门峡 472000

急性髓系白血病（AML）属血液系统恶性肿瘤，肿瘤细胞通常起始于尚未分化为白细胞的骨髓细胞，或者其他类型的造血细胞，表现为原始的肿瘤细胞大量增生，引起外周血的异常改变［1］。其主要症状有贫血、出血、感染、全身肝脾和淋巴结肿大等，目前，主要通过化疗或移植控制疾病，达到缓解状态后，仍旧有较高的复发风险，其根本原因是仍有微小病灶的残留。复发后的疾病治疗起来更加棘手，因此最大程度的清除微小病灶可大大提高患者生存率，延长缓解期［2-3］。基于目前肿瘤免疫治疗的研究如火如荼，有研究报道［4-5］，细胞免疫功能直接关系到血液系统肿瘤疾病的形成、发展和预后，在这之中，T 淋巴细胞作为关键的免疫细胞，受病原体的刺激后可产生细胞毒T细胞，该细胞可特异针对肿瘤细胞发挥免疫作用。然而，现罕有报道指出T淋巴细胞亚群参与AML 疾病的作用，对疾病的发生发展和预后的联系仍未明确。因此，本研究将选取健康人群、AML 复发患者及未复发患者为研究对象，探讨T 淋巴细胞亚群在不同人群间的分布，并进一步阐述其对预测复发所带来的作用，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016 年4 月—2018 年4 月三门峡市中心医院收治的100 例急性髓系白血病患者病历资料，作为初诊AML 组，该组男45 例，女55 例，平均年龄（28.31±5.28）岁；同时选取同时期正常体检的20名健康人，作为健康人群组，该组男11例，女9例，平均年龄（28.66±5.88）岁。两组患者一般资料具有可比性（P＞0.05）。纳入标准：（1）在医院首次确诊为AML。（2）发病时间在1 周以内。（3）排查其他恶性肿瘤的可能。排除标准：（1）病程超于一星期。（2）多脏器衰竭。（3）妊娠期妇女。（4）既往接受过其他治疗。（5）长期免疫抑制剂治疗。

1.2 方法

AML患者均给予诱导方案治疗，依据患者病情程度及自身承受能力范围进行个性化选择，并于骨髓抑制期进行血常规监测，输注血制品，以及配合抗菌药物使用。所有研究对象进行外周血T淋巴细胞亚群检测，空腹时抽取3 mL静脉血，确保2 h前不服用任何药物的情况下采血。将乙二胺四乙酸加入血液标本，防止沉淀物析出。吸取100 μL血液置于流式检测管，再向其加入20 μL 单克隆抗体，于黑箱内37 ℃孵育15 min。取出流式检测管，向其加入2 mL红细胞裂解液，混匀后置于黑箱内37 ℃孵育10 min，用3 000 r/min 的转速将血清分离10 min，得到血清放置于-20 ℃恒温箱中保存，所有血液标本状态均无出现黄疸、溶血。除去上清液，加入PBS 液洗涤，冲洗3 次后，加入500 μL PBS 溶液混匀，放入流式分析仪检测CD3+、CD4+及CD8+，计算CD4+与CD8+比值。

1.3 观察指标

比较初诊AML 组和健康人群组外周血T 淋巴细胞亚群水平；以2018 年4 月—2021 年4 月内是否复发为依据，将初诊AML组分为对照组（未复发和完全痊愈病例）和复发组。其中对照组63 例，复发组37 例。统计并比较两组患者平均年龄、病程、疾病遗传史例数、以及治疗前后外周血T 淋巴细胞亚群水平及差值；使用COX 回归分析探究外周血T淋巴细胞亚群的表达变化与AML 患者复发风险之间的相关性。

1.4 疗效及复发判定标准

（1）复发标准。指骨髓中原始细胞或病变细胞数量为总细胞数量的5%以上，和（或）发现病变范围超过骨髓。（2）完全痊愈标准。Ⅰ：AML临床症状消失；Ⅱ：骨髓中原始细胞或病变细胞数量低于5%；Ⅲ：奥式小体复查发现不存在；Ⅳ：脱离红细胞输注；Ⅴ：凝血功能正常，无白血病细胞；Ⅳ：髓外无病变细胞。（3）未复发标准。较上一次检查而言，髓内原始细胞比例下降50%以上。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数和百分比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 初诊AML 组和健康人群组外周血T 淋巴细胞亚群水平情况

初诊AML 组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群组，CD8+水平显著高于健康人群组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 初诊AML组和健康人群组外周血T淋巴细胞亚群水平情况（±s）

表1 初诊AML组和健康人群组外周血T淋巴细胞亚群水平情况（±s）

组别初诊AML组（n=100）健康人群组（n=20）t值P值CD3+（%）49.25±5.36 70.94±7.59 15.327 0.001 CD4+（%）28.64±6.35 42.12±5.48 8.850 0.001 CD8+（%）33.76±8.12 27.84±7.03 3.038 0.003 CD4+/CD8+（%0.87±0.21 1.68±0.61 10.622 0.001

2.2 影响复发的单因素分析结果

治疗后，复发组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于对照组，CD8+水平均低于对照组，且治疗前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 影响复发的单因素分析结果

2.3 影响复发的COX多因素分析结果

治疗前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者独立复发的危险因素，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 影响复发的COX多因素分析结果

3 讨论

多名学者表示［6-7］，80%以上的AML 患者采取IA（去甲柔红霉素+阿糖胞苷）治疗缓解率高，为AML 的救治提供了更佳的选择。但由于患者因复发使治疗更为棘手，病死人数较多。研究指出，二次复发的AML患者体能状态评分较低，应用标准化疗的疗效并不显著，但在早期及时干预未来可能复发的患者，在化疗方案的基础上增加分子靶向药物，可明显改善患者的CR率和生存率［8-9］。因此预测复发是高缓解率和长生存期的保障，制定预测复发模型可帮助指导医师判断病情，从而制定更规范的诊疗计划。

T 淋巴细胞作为参与抗肿瘤免疫的关键物质，其数量占比为外周血淋巴细胞的70%。CD3+可将上源受体的信号连续传导，其数量和功能状态代表了总T 淋巴细胞亚群水平。根据淋巴细胞的表型和功能的不同，人为将T 细胞分为CD4+和CD8+细胞。CD4+细胞在防控癌症方面发挥关键作用，其与组织相容性复合体结合后具有识别异类细胞的功能，启动自身防御机制，分泌TNF 杀灭肿瘤，并促进CD8+细胞的生殖，激活其状态，启动细胞毒T 细胞效应，发挥特异性免疫机制。观察CD4+细胞比例的变化不失为判定机体免疫状态的一种方式，值得关注的是，部分CD4+细胞可分化为Treg 细胞，该类细胞可阻滞以上免疫机制，抑制T淋巴细胞的功能状态。报道显示，Treg 细胞可抑制淋巴细胞杀伤活力，与肿瘤免疫无能息息相关。另外，CD3+细胞是T 细胞亚群整体数量的反映，其水平的减少提示整体免疫功能将有所下降。CD8+细胞同样具有调控肿瘤免疫机制的能力，可产生穿孔素，或是激活凋亡机制，影响肿瘤细胞的生命力。与此同时，CD8+细胞也可抑制CD4+细胞的激活、繁殖，因此各细胞可通过自身监控来维持数量和比例，保证免疫机制的各种功能正常运行。CD4+/CD8+值的波动幅度直接影响抗肿瘤免疫的能力，二者细胞的比例失衡可促进肿瘤细胞的种植，缩短患者的生存期。

研究表明，在血液肿瘤患者的血常规中，常出现T 淋巴细胞亚群水平的异常。各细胞数量发生改变，则会引起免疫功能的失调，导致白血病的发生率急速上升。此外，T 淋巴细胞分化抗原在白血病细胞的影响下，表达能力失调，导致病情恶化进一步加重；IL-10 等免疫抑制分子也受白血病细胞的控制，活性大大增加，导致白血病的恶性生物学行为进一步加快。研究结果表示，初诊AML 组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群组，CD8+水平显著高于健康人群组。提示AML 的恶变肿瘤细胞打破了T淋巴细胞亚群的平衡状态，肿瘤细胞成功“逃逸”，导致T淋巴细胞介导的免疫机制丧失了对其生长的控制。

有报道指出［10］，化疗虽存在降低外周白细胞的缺陷，如淋巴系统，但机体可做出一系列适应性变化，如帮助启动淋巴增值系统的自稳定性功能，增高组织或器官内淋巴细胞数量，使免疫功能得到稳定。化疗不仅可杀灭癌细胞，还可抑制肿瘤细胞对免疫功能的破坏能力，使T 细胞亚群的状态趋于稳定，有利于生理功能的恢复。CD8+水平的上调提示细胞免疫活性将受到抑制，可通过CD4+/CD8+水平的变化得到有效的证实，CD4+/CD8+水平的升高提示免疫功能得到改善。本研究还探讨了治疗后各细胞数量和比例的变化，结果显示治疗后，复发组CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于对照组，CD8+水平均低于对照组。这表示AML患者经规范治疗后免疫功能有所上调。如果当CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均下降后，B 细胞将调控补体的生成机制，促进补体的产生，损伤细胞的正常生理功能。究其原因ALM 患者在脊髓抑制期状态后，免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸的能力亦下降。但若通过有效的治疗，药物将有效抑制细胞免疫进一步损伤的可能，正如CD4+/CD8+水平升高即可得到提示。研究表明，当CD4+/CD8+水平的提高意味着细胞免疫的正调节点占主导地位，这提示研究者经治疗后的AML患者抗肿瘤能力得到了显著提高。

本文通过单因素分析发现，复发组和对照组治疗前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值存在明显差异，提示诱导治疗方案可影响细胞免疫功能。研究表明，化疗可对细胞免疫有显著抑制功能。两组患者治疗前T 淋巴细胞亚群水平并无明显差异，但治疗后T 淋巴细胞亚群水平波动较大，说明治疗后细胞免疫的变化与复发存在一定联系。本文通过COX 多因素回归分析发现，治疗前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者独立复发的危险因素，这表示免疫紊乱的AML患者与预后不佳存在直接联系，证实治疗前后T淋巴细胞亚群的差值是预测AML 危险度的模型，但未来还需更多基础实验来验证该结论。

综上所述，针对AML 患者，追踪T 淋巴细胞亚群水平的变化可帮助判断预后，明确免疫状态，应用前景广阔。未来还需再评价在T 淋巴细胞亚群水平在估计疗效、判断微小残留病灶方面的价值，以制定更佳的治疗方案，延长患者生存期。