锌指蛋白502在肺腺癌中的表达及作用机制

马小雯，范明伟，杜江

（中国医科大学 1.基础医学院病理学教研室；2.临床二系106期，沈阳 110122）

肺癌是全球发病率最高的癌症，严重影响人类健康［1］。肺腺癌是肺癌的主要组织学亚型，发病率逐年增加，其5年生存率仅约为 15%，绝大多数患者在诊断时已为晚期［2］。因此，寻找肺腺癌的预后标志物和治疗靶点至关重要。

p53是一种经典的抑癌基因，被称为“基因组守护者”，其在保持基因组完整性方面具有关键作用［3-4］。p53在肺癌患者中被认定为早期诊断标志物［5］。当细胞受到外界环境刺激时，p53可以介导细胞周期阻滞，从而导致细胞衰老或细胞凋亡［6］。GADD45是p53的靶基因，已被证明其可以在G2/M细胞周期检查点抑制细胞周期进程。GADD45在G2/M检查点通过抑制细胞周期特异性激酶CyclinB1和CDC2来阻滞细胞周期［7］。锌指蛋白502 （zinc finger protein 502，ZNF502） 是C2H2型锌指蛋白家族成员，定位于人类染色体3p21.31。LI等［8］研究显示ZNF502可能是抑郁症的易感基因，截至目前，ZNF502在恶性肿瘤组织中的表达模式和生物学功能尚不清楚。

本研究采用生物信息学分析方法和Western blotting实验探讨ZNF502在肺腺癌患者中的表达模式，利用一系列细胞功能实验探究ZNF502对肺腺癌细胞增殖能力的影响，为进一步研究ZNF502在肺腺癌发生发展中的具体作用机制提供线索和依据。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

1.1.1 TCGA数据库：采用仙桃学术在线网站（https：//www.xiantao.love/products） 对TCGA数据库中肺腺癌数据集进行表达差异和预后相关性分析。

1.1.2 GEPIA数据库：采用GEPIA数据库 （http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php） 对ZNF502和TP53mRNA的表达相关性进行预测。设置筛选条件为 （1） Gene：ZNF502，TP53；（2） Datasets selection：BRCA；（3） Correlation Coefficient：Person。

1.1.3 Linkedomics在线网站：应用Linkedomics （http：//www.linkedomics.org/login.php） 对ZNF502进行基因集富集分析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 。

1.2 细胞培养

永生人支气管上皮细胞系HBE，人类肺腺癌细胞系H1299、LK2，A549购自武汉普诺赛 （中国Procell公司）。所有细胞均使用RPMI-1640 （美国Invitrogen公司） 培养，培养基中添加10% 胎牛血清 （美国Invitrogen公司），1%青霉素和链霉素 （美国Sigma-Aldrich公司）。所有细胞均置于温度37 ℃，5% CO2的细胞培养箱中。所有细胞系均采用短串联重复序列（short tandem repeat，STR） 进行鉴定，无支原体污染。

1.3 质粒构建

过表达质粒pCMV6-ZNF502-Myc-DDK和对照质粒PCMV6购自美国Origene公司。敲除序列pLV2-U6-ZNF502-sgRNA-cas9-GFP由吉凯基因 （中国吉凯基因公司） 设计。转染均使用lipo3000（美国Invitrogen公司）。

1.4 Western blotting

采用NP40裂解液 （中国碧云天公司） 从细胞中提取总蛋白。12 000 r/min，4 ℃离心保留上清液，并使用BCA试剂盒定量 （中国碧云天公司）。100 ℃金属浴加热样品5 min，使蛋白质变性。采用10% SDSPAGE分离40 μg蛋白，100 V，60 min将蛋白转印到PVDF膜 （美国Millipore公司） 上。5%的脱脂奶粉室温封闭PVDF膜2 h后，在4 ℃与以下抗体孵育过夜：ZNF502、GAPDH、P53、CyclinB1、CDK1、GADD45a和Myc-tag （均以1∶1 000稀释，美国Abcam公司）。24 h后将PVDF膜与以1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶偶联抗小鼠IgG和抗兔IgG （中国碧云天公司） 室温孵育2 h。增强化学发光法 （electrochemiluminescence，ECL） 检测蛋白表达，采用ChemiDoc Imaging System进行采集图像。采用GAPDH作为对照来计算相对蛋白表达量。

1.5 免疫荧光实验

在细胞传代培养时，将细胞接种到预先放置盖玻片的24孔板中，待细胞融合率接近80%时，磷酸盐缓冲液清洗2次。室温下用4% 多聚甲醛敷育细胞10 min，0.5% Triton X-100通透液室温下敷育细胞10 min，使用含有3% 牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭细胞2 h。将细胞与溶有ZNF502抗体 （1∶100） 的磷酸盐缓冲液在4°C下孵育过夜。24 h后将细胞使用磷酸盐缓冲液洗涤2次，与荧光二抗Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594 （1∶50，中国碧云天公司） 在室温下孵育1 h，避光。最后，用含4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI） 的封片剂染色细胞核10 min。将细胞爬片使用共聚焦显微镜获取图像。实验重复3次以上。

1.6 MTS细胞增殖实验

培养过表达ZNF502的A549细胞和敲除ZNF502的LK2细胞到对数生长期。取96孔细胞培养板，每孔加入0.1 mL 2 000个上述细胞的RPMI1640培养液，设置5个复孔。在37 ℃ 5%CO2的培养箱中分别培养24、48、72和96 h后，每孔加入20 μL MTS，继续培养1.5 h后进行显色。在酶联检测仪波长490 nm处检测各孔吸光度 （optical density，OD）。实验重复3次以上。

1.7 集落形成实验

培养过表达ZNF502的A549细胞和敲除ZNF502的LK2细胞到对数生长期。在6孔板每个孔中加入1 000个细胞，放入CO2培养箱培养。1周后，当肉眼可见集落形成时，取出6孔板。每孔加入1 mL冰甲醇固定15 min后，加入结晶紫染色10 min，自来水反蓝。计数集落，实验重复3次以上。

1.8 EdU增殖实验

培养过表达ZNF502的A549细胞和敲除ZNF502的LK2细胞至融合率为70%～80%时，用20 μmol/L的EdU溶液 （中国雅酶生物公司） 在37 ℃ 5% CO2培养箱中孵育细胞1 h后，弃培养基。用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次之后，所有步骤按照免疫荧光实验进行。

1.9 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，组间差异采用t检验。采用Kaplan-Meier法和多因素Cox回归法分析ZNF502与生存预后的关系。P< 0.05为差异有统计学意义。所有实验至少重复3次。

2 结果

2.1 ZNF502在肺腺癌组织和细胞中的表达（图1）

对TCGA公共数据库中的多种癌和癌旁样本进行差异分析。结果显示，ZNF502在多种肿瘤组织中的mRNA表达水平显著低于癌旁组织 （图1A）。且在配对的肺腺癌组织中表达显著低于癌旁组织 （P<0.01，图1B）。肺腺癌细胞系A549，H1299和LK2中ZNF502的蛋白水平明显低于正常支气管上皮细胞HBE （图1C）。本研究选取表达量最低的A549细胞系进行后续的过表达实验，选取表达量相对较高的LK2细胞进行后续的敲除实验。免疫荧光实验结果显示，内源和外源的ZNF502均主要表达于肺腺癌细胞的细胞核中 （图1D）。

图1 ZNF502在肺腺癌组织和细胞中低表达Fig.1 ZNF502 was low expressed in lung adenocarcinoma tissues and cells

2.2 ZNF502过表达与患者预后的相关性

对TCGA数据库中的肺腺癌患者临床数据进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示，ZNF502高表达的肺腺癌患者总体生存期 （overall survival，OS） 和疾病特异性生存期 （disease specific survival，DSS） 显著高于ZNF502低表达的患者，且风险比率 （hazard ratio，HR） 均<1 （P= 0.014和P= 0.018，图2A、2B）。将患者按ZNF502的mRNA表达量分群并绘制风险因子图，发现ZNF502高表达的患者存活更多且有更低的风险评分 （图2C）。接下来对肺腺癌相关的临床病理因素和ZNF502的表达进行多因素Cox分析，结果显示，ZNF502可以作为评价肺腺癌预后的独立保护因素。ZNF502可以联合T分期和N分期作为肺腺癌的预后评价因子 （HR=0.738，P< 0.001，图2D）。

图2 ZNF502高表达患者预后良好Fig.2 A high level of ZNF502 expression was associated with a good prognosis

2.3 ZNF502过表达抑制肺腺癌细胞增殖能力（图3）

利用linkedomics网站进行在线GSEA富集分析，结果显示，ZNF502主要与细胞周期、帕金森病和泛素化等通路呈负相关 （图3A、3B）。对TCGA数据库的肺腺癌数据集进行通路相关性分析，ZNF502与G2/M检查点通路显著负相关 （P= 0.013，图3C）。结果显示，ZNF502可能通过调控细胞周期来影响患者的预后。细胞周期主要控制细胞的增殖能力。Western blotting实验结果显示，ZNF502在A549细胞中被成功过表达，在LK2细胞中被成功敲除 （图3D）。MTS、集落形成实验和EdU增殖实验结果显示，过表达ZNF502显著抑制肺腺癌细胞的增殖能力。而敲除ZNF502则显著增强肺腺癌细胞的增殖能力 （图3E～3G）。

图3 ZNF502过表达抑制肺腺癌细胞增殖Fig.3 Overexpression of ZNF502 inhibited the proliferation of lung adenocarcinoma cells

2.4 ZNF502通过激活P53通路抑制细胞周期

利用GEPIA网站对ZNF502和下游基因进行相关性分析，结果显示，ZNF502和TP53的表达呈正相关（r= 0.14，P= 0.001 4，图4A）。接下来在过表达ZNF502的A549细胞中检测p53下游蛋白表达水平。Western blotting实验结果显示，p53，GADD45a表达明显上升，而G2/M检查点关键蛋白CyclinB1和CDK1表达明显下降 （图4B）。在ZNF502敲除的LK2细胞中，上述蛋白表达量的变化恰恰相反 （图4C）。过表达ZNF502可能通过激活p53-GADD45a通路抑制细胞G2/M转化，从而抑制肺腺癌细胞的增殖能力。

图4 ZNF502通过激活p53通路抑制细胞周期Fig.4 ZNF502 inhibited the cell cycle by activating the p53 pathway

3 讨论

ZNF502是锌指蛋白转录因子家族的成员，其在肺癌中的表达模式和生物学功能仍未有文献报道。此外，ZNF502表达与患者预后之间的相关性也未见文献报道。本研究结果显示，与癌旁组织相比，ZNF502在肺腺癌组织中的表达相对较低。ZNF502主要定位在细胞核中发挥生物学功能。此外，ZNF502的高表达与患者的良好预后呈正相关，ZNF502或许可以作为一个新的评价肺腺癌良好预后的标志物。而且，ZNF502mRNA的表达可以作为评估为肺腺癌进展的独立保护因素。

GSEA富集分析以及一系列检测细胞增殖能力的功能学实验表明，ZNF502可能通过调节p53信号通路来抑制细胞增殖能力。ZNF502和TP53的表达呈正相关。p53已被证实是调控细胞周期的上游关键因子，发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用［9-10］。野生型p53的高表达与肿瘤放化疗敏感性和良好预后密切相关。在基因组受到外界损伤时，p53响应外界刺激，介导细胞周期阻滞，开启DNA损伤修复通路。当基因组损伤不可修复时，p53主要开启细胞凋亡通路，引导细胞程序性死亡［11-12］。

本研究进一步采用Western blotting检测p53通路关键下游蛋白。结果显示，ZNF502通过上调p53的表达水平，激活下游关键因子GADD45a，从而使细胞周期阻滞在G2/M检查点。突变型p53在肿瘤中将发挥与野生型p53截然不同的功能［13］。临床约有50%的肺癌患者存在p53突变。p53蛋白可以发挥转录因子的功能，其突变位点主要位于中央的DNA结合结构域。R175、G245、R248、R249、R273和R282是最常见的6个错义突变位点。突变的p53半衰期明显延长，不再具有野生型p53抑制细胞增殖的能力。突变型p53诱导上皮-间充质转化，放化疗抵抗在肿瘤细胞的侵袭和转移中起关键作用［14］。本研究中使用的A549和LK2细胞都不存在p53突变，仅检测了ZNF502对野生型p53的调控作用，ZNF502对突变型p53的影响将在未来的实验中进一步探究。

综上所述，ZNF502在肺腺癌组织中显著低表达，主要定位于细胞核中且与肺腺癌患者的良好预后呈正相关。ZNF502通过激活p53-GADD45a通路抑制细胞G2/M转化，从而抑制肺腺癌细胞的增殖能力。