ANRIL,PON基因及其交互效应对急性缺血性脑卒中后认知损伤的影响*

刘生刚 肖雷 段园园 邓小红 王亚军 柳华

(1.绵阳市人民医院神经内科·川北医学院,四川 绵阳 621053;2.成都市第三人民医院·西南交通大学附属医院神经内科,四川 成都 610014)

脑卒中是我国居民首位死因,目前发病率为246.8/10万,死亡率为114.8/10万[1-2],而缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)是脑卒中的主要类型,占所有脑卒中的43.7%～78.9%[1]。卒中后认知损伤很常见,超过70%的卒中患者在病后3月后会出现不同程度认知损伤(Cognitive impairment,CI),导致失能和死亡率增加,给患者、照护者、家庭、医疗系统和社会增加了严重负担[3]。其中,IS急性期CI发生率约为30%～50%[4-5]。因此,研究急性IS后认知损伤(Post stroke cognitive impairment,PSCI)的危险因素,对于预防和针对性治疗极为重要[6]。认知损伤具有明确的遗传背景,研究发现,24%的认知损伤可归因于遗传易感因素[7]。最近一个全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)在3个苏格兰人群中证实IS的多基因风险与PSCI密切相关[8]。长链非编码RNA家族的INK4基因座中反义非编码RNA(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)与IS发病密切相关[9]。ANRIL参与了炎症和神经功能失调的调节,可能在阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的发病机制中起作用[10]。研究者在AD细胞模型中也发现ANRIL表达上调,通过沉默ANRIL可以减少细胞凋亡,增强神经突触生长,并降低炎症因子TNF-α、IL-1β、L-6和IL-17的水平[11]。对氧磷酶(Paraoxonase,PON)参与脂质代谢,和动脉粥样硬化过程关系密切。Meta分析显示,PON基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)与IS的发病具有紧密相关性[12-14];PON1 L55M(rs854560)与血管性痴呆(Vascular dementia,VaD)[15],PON2 S311C(rs7493)和rs705379与AD的发病风险相关[16]。由此推测,ANRIL和PON基因可能是PSCI的发生遗传易感因素,并且,PSCI是一个多因素疾病,本研究旨在探讨上述2个基因及其与CI传统危险因素的交互效应,以期为PSCI的防治提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取绵阳市人民医院神经内科连续入院的符合纳入标准的汉族初发IS患者。纳入标准:①符合世界卫生组织(WHO)IS诊断标准。②发病14天内,发病前无认知障碍及其他影响智能的神经精神疾患。③患者及家属知情并签署知情同意书,同时经医院伦理委员会审核通过。排除标准:①腔隙性脑梗死、有明确原因的继发性脑梗死、再发性脑梗死患者。②伴有意识障碍、言语障碍、严重视听损害不能进行认知评测者。③存在其他严重合并症和并发症者;④影像学发现脑白质病变、脑萎缩者。

1.2 研究方法

1.2.1 评价指标 ①认知评定:发病后2周采用简易智能量表(Mini-mental State Examination,MMSE)中国版本进行认知测定,MMSE<27分诊断为认知损伤。②神经功能缺损评定:使用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)进行评估,神经功能损伤程度较重定义为NIHSS>5(非轻型卒中)。③高同型半胱氨酸(HHCY)定义采用2011中国高血压防治指南修订委员会制定的标准:血浆Hcy>10 μmol/L。④高危CRP定义为hs-CRP>3.0 mg/L。⑤高尿酸定义采用中国高尿酸血症与痛风诊疗指南(2019)定义:为非同日两次血尿酸水平>420 μmol/L。⑥入院高血糖参照1998年WHO标准:空腹 ≥ 7.0 mmol/L,或者随机 ≥ 11.1 mmol/L。⑦ 入院高血压根据1999年WHO高血压标准:即收缩压≥140 mmHg和(或)舒张压≥90 mmHg。⑧吸烟史定义为平均每日吸烟1支以上,时间大于一年;饮酒史定义为平均每周饮白酒至少一次,时间大于一年)[17]。⑨血脂异常诊断依据中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版):甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L(150 mg/dl)、血浆胆固醇(TC)≥5.18 mmol/L(200 mg/dl)、高密度脂蛋白(HDL-C)<1.04 mmol/L(40 mg/dl)、低密度脂蛋白(LDL-C)≥3.37 mmol/L(130 mg/dl)。⑩超重定义为BMI≧24 kg/m2。颈动脉狭窄程度:在最大斑块位置,采用NASCET方法计算颈动脉狭窄率,将颈动脉狭窄程度分为:正常、轻度狭窄(1%～49%)、中度狭窄(50%～69%)、重度狭窄(70%～99%)、血管闭塞(血栓填塞,血流信号消失)。梗死面积定义(CT/MRI):根据Pullicino公式,将脑梗死面积分为大、中、小三型,其中小梗死灶<4 mL,中梗死灶5～10 mL,大梗死灶>10 mL。

1.2.2 SNP分型

1.2.2.1 ANRIL SNPs位点的选择 根据在Hapmap数据库(HapMap Data Phase III/Rel#2,Feb09,on NCBI36 B36 assembly,dbSNP b126)中获得的中国非亲缘关系北京人群的所有SNP基因分型数据,挑选出r2≥0.8且最小等位基因频率(MAF)> 5%的SNPs作为标签SNPs。位于5′和3′侧翼区以及非转录区(UTRs)的SNPs也纳入分析。最后,15个SNP位点纳入分析,包括rs2184061,rs7044859,rs10738607,rs1537375,rs1004638,rs10738609,rs10757278,rs10757274,rs2383206,rs1333049,rs1333040,rs10116277,rs10757269,rs1537378和rs7865618。

1.2.2.2 PON位点选择 选择在脑血管疾病及认知功能研究较多的位点,共涉及9个位点(rs12026、rs3735590、rs662、rs705379、rs705381、rs7493、rs854560、rs854571和rs854572)。

1.2.2.3 DNA提取 取每个受试者外周静脉血2 mL于内含EDTA-K2(K3)抗凝剂的紫头管,于-80 ℃冰箱保存。采用北京TIANGEN公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit)(离心柱型),目录号:DP348)提取DNA。

1.2.2.4 SNPs分型采用SNPscan方法(Cat#:G0104K,上海天昊生物科技有限公司) 该技术是根据提供的SNP信息合成特异引物并优化连接反应体系后组装而成。实验步骤简述如下:①DNA样本浓度在30～50 ng/ul。②样本裂解:使用2.5 ul 4x DNA lysis Buffer,在PCR仪上98 ℃,5 min裂解。③连接反应:使用裂解DNA样本,加入10 μL连接反应预混合液,3 000 rpm离心0.5 min,在PCR仪按以下程序运行:第一步,4个循环,包括:94 ℃,1 min,58 ℃,4 h;第二步,94 ℃,2 min,72 ℃保持。④多重荧光PCR反应(每个样本进行两个PCR反应,每个反应各扩增48位点的连接产物),连接产物1 ul加19 ul PCR预混合液,3000 rpm离心0.5 min,然后在PCR仪按以下程序运行:第一步,95 ℃,2 min变性,第二步,9个循环:94 ℃,20秒变性,首次循环62 ℃,40秒退火(后续每个循环降低0.5 ℃),72 ℃延伸1.5 min;第三部,25个循环:94 ℃,20秒变性,首次循环57 ℃,40秒退火,72 ℃延伸1.5 min;第四步,68 ℃ 60 min延伸。⑤PCR产物上ABI 3730XL测序仪:PCR产物稀释10倍后,取1 ul与0.5 ul Liz 600 SIZE STANDARD,8.5 ul Hi-Di混匀,95 ℃变性5 min后上ABI 3730XL测序仪。⑥数据分析:ABI 3730XL测序仪上收集的原始数据用软件GeneMapper 4.1(AppliedBiosystems,USA)分析。

2 结果

2.1 一般资料 研究期间,共纳入312例急性IS患者,根据纳入排除标准,共255例IS患者进入本研究分析。根据MMSE评测,88例患者存在认知损伤,认知损伤的比例为34.5%,平均年龄(64.01±4.51)岁,男性52例,女性36例;认知正常167例,年龄(62.03±5.65)岁,男性91例,女性71例。调整协变量多因素分析后显示,认知损伤组年龄较大,更多见大中体积梗死、非轻型梗死、颈动脉中重度狭窄和高hs-CRP值。认知正常IS患者右侧梗死多见。病例组与对照组的人口统计学特征和临床特点,见表1。

表1 PSCI和对照组临床特点[M(P25,P75)]

2.2 SNPs关联分析 在总体样本的所有遗传模式下,经调整协变量后,多元Logistic回归分析显示,5个位点影响了急性PSCI的发病,rs10116277 G等位基因携带者发病风险更小(P=0.001),rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493位点GG基因型、以及rs3735590位点A等位基因增加了发病风险(P<0.05)。见表2。

2.3 交互作用分析 采用MDR软件评估总人群PSCI可能的基因-基因,基因-传统危险因素交互作用的影响,PSCI传统危险因素分析中P≤0.10的因素都被纳入交互分析。我们发现,在基因-基因交互作用分析中,三阶交互模型rs10116277、rs3735590和rs7493是最佳模型。在基因-传统危险因素交互分析中,ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP三阶交互,rs10116277、rs1333049和右侧脑梗死的三阶交互,rs10116277、rs1333049和大中面积梗死体积的三阶交互,rs10116277和中重度颈动脉狭窄的二阶交互,rs10116277、rs1333049和65岁及以上人群的三阶交互,PON rs7493与右侧脑梗死二阶交互,rs3735590

与大中面积梗死体积的二阶是最佳模型,具有最高TBA。然而,在Logistic回归分析中,只有ANRIL rs10116277、rs1333049和hsCRP,rs10116277、rs1333049和大中面积梗死体积,rs10116277和中重度颈动脉狭窄,PON rs7493和右侧脑梗死,rs3735590和大中面积梗死体积交互作用具有统计学意义,见表3。Logistic回归分析用来评估最佳交互模型对PSCI的效应,调整协变量后,本研究发现,携带ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hsCRP患者,发生急性PSCI的比率为5.049倍(OR=5.049,95%CI:1.650～15.448,P=0.005);携带ANRIL rs10116277 TT基因型,rs1333049 CC基因型的大中面积脑梗死患者,发生急性PSCI的比率为8.322倍(OR=8.322,95%CI:2.458～28.171,P=0.001);rs10116277 TT携带者加上颈动脉中重度狭窄,PSCI发生率为4.067倍(OR=4.067,95%CI:1.832～9.027,P=0.001);rs3735590 GG携带者加上大中面积梗死,PSCI发生率为5.176倍(OR=5.176,95%CI:2.343～11.436,P<0.001)。其它交互效应未见统计学意义。

3 讨论

本研究通过分析动脉粥样硬化相关基因ANRIL与PON的SNP位点与PSCI发病风险相关性,发现了新的PSCI潜在预测指标。本研究还发现,5个SNPs位点影响了急性PSCI的发病,rs10116277 G等位基因具有保护效应,rs1333049 C等位基因、rs12026和rs7493 GG基因型、rs3735590 A等位基因增加了PSCI发病风险。

ANRIL是染色体9p21区域一段长3.8 kb的非编码RNA,广泛参与了动脉粥样硬化疾病的发生[9,18]。在大鼠糖尿病模型中,ANRIL下调能重建学习和记忆能力,避免海马锥体神经元的凋亡[19]。在AD细胞模型中,ANRIL敲除能抑制凋亡和炎症因子细胞因子表达,促进神经突的生长[10]。这些都是AD发病的关键机制。研究也发现,ANRIL rs10116277位点风险等位基因增加了白人群体冠脉病变发生1.45倍[20]。在高加索人群中,冠状动脉旁路移植术后,rs10116277风险基因携带者更易出现心肌损伤[21]。在中国AD人群中研究发现,rs1333049 C等位基因增加了晚发性AD的发生[22]。在意大利人群中,rs1333049 C等位基因也增加了VaD和晚发性AD的发病风险[23]。

表2 5个SNPs位点在不同遗传模型下在认知损伤组和正常组中的分布情况

表3 ANRIL,PON基因交互作用模型表

PON是高密度脂蛋白相关的有机磷酸酯水解酶,具有水解内酯、硫内酯、芳基酯和不同有机磷酸盐的能力,具有抗动脉粥样硬化的生理作用[24]。PON基因与动脉粥样硬化相关疾病具有密切关系,在Gran Canaria岛北部地区,rs7493 GG基因型增加了颈动脉IMT的风险[25];在新加坡华人中,不吸烟人群中rs3735590少见等位基因(A)携带者患CHD的风险更高[26]。GWAS研究也揭示,PON1基因一个SNP与AD发病风险有关[27]。Meta分析显示,PON1 L55M (rs854560) M等位基因有更高的VaD发病风险[15]。综上,ANRIL,PON基因与动脉粥样硬化疾病关系密切,本身也涉及到认知损害的病理生理过程,因此,可以理解ANRIL,PON基因与急性PSCI发病风险的关系。

本研究交互作用分析也发现,携带ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的高hs-CRP患者,携带ANRIL rs10116277 TT基因型和rs1333049 CC基因型的大中面积脑梗死患者,携带rs10116277 TT基因型的颈动脉中重度狭窄患者,以及携带rs3735590 GG基因型的大中面积梗死患者PSCI发生率显著升高。

卒中后认知损伤风险因素众多,比如高龄(65岁以上)、血管危险因素、梗死部位大小等本身特点以及遗传易感因素等交互而成[28]。在CHD患者中,rs1333049 CC基因型被发现与升高的CRP有关[29],ANRIL过表达增加了糖尿病心肌梗死鼠的心肌梗死体积[30],颈总动脉狭窄患者ANRIL表达更低[31]。上述基因与传统危险因素的复杂相互作用有助于我们理解上述的交互效应,对于IS后急性期CI的防治极其重要。

ANRIL和PON基因与PSCI研究甚少,前期,本研究团队报道在川东北人群PON基因与PSCI存在关联[32],然而,由于认知测试方法差异,以及PSCI本身是一个多因素疾病,基因多态性有较强的种族及地域差异性,因此,以SNP作为遗传标志物,在川西北PSCI人群中,研究其遗传关系及相互交互作用,对于揭示PSCI发生机制更有优势。本研究成果不仅丰富了目前对PSCI遗传特性的认知,也为临床诊疗提供了参考。本研究也存在一定缺陷,如纳入分析样本来源范围较窄、数量较小等,后期研究结果的进一步验证还需要扩大病例纳入范围及数量。

4 结论

ANRIL,PON基因与PSCI发病风险密切相关。为了解IS人群后期认知障碍的发病、进展、转归、治疗情况与本研究基因的关系,应对研究对象进行长期随访观察,建立资料库进行对比研究。