菌磷耦合下紫花苜蓿的干物质产量及磷素空间分布特征

刘选帅，孙延亮，马春晖，张前兵

（石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

磷是植物生长发育过程中必需的三大营养元素之一，也是影响作物产量的关键因素。实际生产中，人们常通过施肥来增加土壤磷含量进而实现作物增产的目的。然而，施入土壤中的磷只有少部分被植株吸收利用，约有70%~90%的无机磷被钙、铁、铝等金属阳离子吸附固定形成难溶性磷酸盐，导致磷素利用效率普遍较低，限制作物生长[1］。磷是地球上不可再生资源，大量施用磷肥不仅造成磷矿资源浪费，还会使磷在土壤富集，引起水体富营养化等环境问题[2］。因此，提高土壤磷素利用效率对农业减肥增效、高质量可持续发展及减少土壤磷污染均具有重要的现实意义。

土壤微生物对土壤有机质的分解和养分的循环发挥着关键的作用。在根际土壤微生物与植物形成的共生体中，根际土壤微生物能够提高土壤中的可利用养分含量，并促进植物吸收利用养分[3］。丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）和解磷细菌（phosphorus solubilizing bacteria，PSB）均为土壤微生物中重要的有益菌群，在促进植物摄取养分方面起着重要作用[4］。AMF 能与宿主植物根系合作共生，其形成的特有菌根结构扩大了植物对土壤磷素的摄取范围，从而改善了植物的磷营养[5］。同时，接种AMF 后，植物根系分泌的磷酸酶及有机酸含量增多，改变了根际土壤pH，这有利于难溶性磷酸盐的水解[6-7］。研究表明，对玉米（Zea mays）及高粱（Sorghum bicolor）接种AMF 后，显著提高了植株全磷含量[8］。PSB 发挥作用的基础是其分泌的磷酸酶和有机酸等物质，通过酶解和酸解作用溶解土壤中不溶性磷酸盐[9-10］，进而增加土壤中植物可吸收磷的浓度。另有研究表明，对小麦（Triticum aestivum）接种芽孢杆菌（Bacillussp.）后，其根际土壤磷含量及植株磷含量得到明显改善[11］。相比于单一接种，混合接种AMF 和PSB 显著增强了植物的生长，两种菌间表现出了明显的协同关系[12］。这是因为AMF与PSB 的联合作用不仅提高了土壤肥力，而且增加了根系微生物的物种丰富度，这些因素共同构成了利于AMF与PSB 生存的根际土壤环境[13］。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种多年生优质豆科饲草，种植苜蓿对优质畜牧业的高质量发展具有十分重要的意义。新疆石河子地区土壤速效磷含量较低，占比不到全磷的1%[14］，而苜蓿是一种磷敏感型植物，缺磷在影响苜蓿生长的同时还间接限制了其生物固氮效率，这最终严重制约了当地苜蓿的优质高效生产。虽然国内外众多学者关于施磷及接菌对植物生长的影响进行了大量研究，但目前关于施磷条件下混合接种解磷菌对苜蓿生长的研究相对较少，尤其是施磷条件下接种不同混合比例AMF 与PSB 对苜蓿植株磷含量及土壤有效磷含量的影响及各指标之间关系的研究则罕见报道。因此，本试验开展施磷条件下不同比例接菌对苜蓿植株磷含量、土壤有效磷含量及干物质产量的影响研究，阐明菌磷交互条件下苜蓿各指标间的相互关系，以期筛选出适合苜蓿高效生产的最佳菌磷互作模式，为提高紫花苜蓿的磷素利用效率及优质高效生产提供理论依据及数据参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿品种选用WL366HQ（购于北京正道生态科技有限公司），其产量高，抗寒能力优秀，耐刈割，持久性强。

AMF 菌剂为摩西管柄囊霉（Funneliformis mosseae），购自青岛农业大学菌根技术研究所，以含有孢子、菌丝体的沙土及其寄主植物白三叶（Trifolium repens）的根段混合物作为菌种接种物，孢子密度为20~30 个·g-1，菌根侵染率大于80%。PSB 选用巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），由中国农业微生物菌种保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China，ACCC）提供，菌种编号为10011。巨大芽孢杆菌自-80 ℃冰箱取出，经活化后用LB 培养基（胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，pH 7.2）在37 ℃下培养24 h，再经灭菌生理盐水调整至108cfu·mL-1浓度的菌液作为PSB 接种菌液。

盆栽基质为灭菌土与珍珠岩（防止土壤板结）[3∶1 （v∶v）］的混合物，供试土壤为灰漠土，采自石河子大学试验站二连牧草试验地（44°20′ N，86°30′ E）0~20 cm 耕层，土壤容重1.46 g·cm-3，有机质24.2 g·kg-1，土壤全氮1.53 g·kg-1，碱解氮68.3 mg·kg-1，全磷0.22 g·kg-1，速效磷15.7 mg·kg-1，速效钾132.6 mg·kg-1。土样风干后过5 mm 筛，剔除石块和植物根段，高压蒸汽灭菌（115 kPa，121 ℃）备用。

1.2 试验设计

试验采用双因素完全随机设计。设接菌和施磷两个因子，其中接菌因素设5 个双接菌比例（AMF∶PSB），分别为：3∶7（施摩西管柄囊霉3 g·pot-1，巨大芽孢杆菌7 mL·pot-1）、4∶6、5∶5、6∶4 和7∶3，依次简记为J1、J2、J3、J4和J5。施磷（磷源为磷酸一铵，含P2O552%）设2 个磷素水平，分别为施P2O5：0（P0）和100 mg·kg-1（P1，当地苜蓿高产田施用量）。共计10 个处理，每个处理重复10 次。

盆栽试验在石河子大学农学院试验园（44°18′ N，86°03′ E）进行。挑选籽粒饱满、大小相近的带包衣的种子于2021 年5 月1 日种入已经提前装入盆栽基质及接过菌剂的花盆中（每盆约含3 kg 盆栽基质），种植深度为2 cm。试验用花盆规格为23 cm×15 cm×17 cm（盆口直径×盆底直径×高），花盆在种植前用75%酒精消毒备用。待苜蓿幼苗长至三叶期进行间苗，留10 株长势均一的苜蓿植株用于后续指标测定。

在幼苗生长期间每隔7 d 施加一次无磷Hoagland’s 营养液（每盆200 mL），同时每天傍晚浇水以保证花盆土壤水分的相对恒定（保持在田间持水量的65%~75%）。于2021 年6 月18 日将提前计算好施用量的磷肥一次性随水施入。为消除磷酸一铵（含N 11.2%）中N 对试验结果的影响，本试验在P0处理施入尿素（含N 46.0%）以使各处理含等量的N。苜蓿在初花期（开花15%）进行收割，共收割3 茬，具体时间为2021 年7 月4 日、8 月15 日和9月21 日。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 干物质产量的测定 每个处理选取长势均匀的苜蓿植株3 盆，用剪刀在距花盆土壤表面2 cm 处剪下植株的地上部分称质量，所得质量即为苜蓿植株的鲜质量。随后将采取的苜蓿鲜样在烘箱中于105 ℃下烘干30 min 后，再于65 ℃下烘干至恒质量，此质量即为苜蓿干物质产量。

1.3.2 苜蓿植株磷的测定 待苜蓿烘干称重后，按苜蓿植株不同部位（地上部上、中、下）及不同器官（茎、叶、花、根）进行人工分离并用小型粉碎机粉碎，采用H2SO4-H2O2消煮-钼锑抗比色法[15］分别测定苜蓿地上部上1/3、中1/3 和下1/3 植株磷含量及茎、叶、花和根中的磷含量。

1.3.3 土壤有效磷的测定 采用抖根法[15］收集土壤，直接从苜蓿根上抖落下来的土为非根际土，用毛刷从根上刷下来的土视为根际土。采回的非根际土和根际土经自然风干过0.83 mm 筛后，采用0.5 mol·L-1的NaHCO3浸提-钼锑抗比色法[15］测定土壤有效磷含量。

1.3.4 磷素利用效率的测定 具体公式[16］为：

1.4 数据处理

使用Microsoft Excel 2019 和DPS 7.05 软件进行统计分析，采用新复极差法（Ducan’s multiple range test，DMRT）进行差异显著性分析，用Origin Pro 2022（Origin Lab，美国）软件进行作图和皮尔逊相关分析。采用隶属函数分析法[17］综合评价出最优处理，具体公式为：

式中：Xij为第i个处理中第j个指标的观测值；Ximax、Ximin分别为所有处理中第j项指标的最大值和最小值。UX（+）为正向指标隶属函数值，UX（-）为负向指标隶属函数值。隶属函数值的范围为0~1。综合所有指标的隶属函数值可以得到各处理的平均隶属函数值，平均隶属函数值越大，相应处理的综合效果越好。

2 结果与分析

2.1 不同处理下紫花苜蓿的植株磷含量

各茬次的接菌、施磷及菌磷交互效应对苜蓿磷含量均有显著影响（P<0.05）（表1 和图1）。相同接菌条件下，除第3 茬J5处理下的苜蓿磷含量为P1与P0之间无显著差异外（P>0.05），其余各茬次各处理的磷含量均表现为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）。P0条件下，除第2 茬的苜蓿磷含量为J3处理显著大于J1、J2、J4和J5处理外（P<0.05），第1 和3 茬均为J5处理显著大于其他处理（第3 茬的J3处理除外） （P<0.05）；P1条件下，前两茬苜蓿磷含量均为J5处理显著大于其他处理（第2 茬的J3处理除外）（P<0.05），而第3 茬各接菌处理间的苜蓿磷含量均差异不显著（P>0.05）。

图1 不同处理下苜蓿植株磷含量Fig.1 Phosphorus content in alfalfa under different treatments

表1 紫花苜蓿磷含量相关指标的主效应均值和统计分析结果Table 1 Main effect means and statistical analysis results of phosphorus content related indexes of alfalfa

2.2 不同菌磷处理下紫花苜蓿不同器官的磷含量

不同菌磷处理下紫花苜蓿不同器官磷含量的结果表明（表1 和图2），施磷、接菌和菌磷互作对苜蓿各器官中磷含量均具有极显著影响（P<0.01）。

图2 不同处理下苜蓿不同器官的磷含量Fig.2 Phosphorus content in different organs of alfalfa under different treatments

相同接菌条件下，除第1 茬的J5处理、第3 茬的J3和J5处理外，苜蓿茎秆磷含量均为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）（图2A）；除第3 茬的J5处理外，苜蓿叶片磷含量均为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）（图2B）；苜蓿花中磷含量表现为除第1、2 茬的J5处理和第3 茬的J2处理中P1处理与P0处理间差异不显著外（P>0.05），其余茬次中各接菌处理均为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）（图2C）；除第1 茬的J2、J4处理及第2 茬的J1、J4和J5处理外，P1处理下的根中磷含量显著大于P0处理（P<0.05）（图2D）。P0条件下，除第2 茬的J2与J5处理间差异不显著外（P>0.05），苜蓿茎秆磷含量各茬次均表现为J5处理显著大于其他各处理（P<0.05）；苜蓿叶片和花中磷含量也均为J5处理显著大于其他各处理（除花中第1、2 茬的J3处理外，P<0.05）；苜蓿根中磷含量除第1 茬外，后两茬均表现为J4、J5处理显著大于J1、J2和J3处理（P<0.05）。P1条件下，苜蓿各器官各茬次磷含量各不相同，无明显规律。苜蓿不同器官磷含量由高到低依次为：花>叶>根>茎。

2.3 不同菌磷处理下紫花苜蓿地上部不同部位磷含量

菌磷交互效应对苜蓿地上部不同部位的磷含量均具有极显著影响（P<0.01）（表1 和图3）；苜蓿上、中、下部位磷含量均对接菌效应有极显著响应（P<0.01）；施磷效应对苜蓿各部位磷含量均有极显著影响（P<0.01）。

图3 不同处理下苜蓿地上部不同部位磷含量Fig. 3 Phosphorus content in different parts of alfalfa shoots under different treatments

相同接菌条件下，苜蓿植株上部磷含量（图3A）除在第1 茬的J5处理、第2 茬的J3处理和第3 茬的J5处理外，其余各处理均为P1显著大于P0（P<0.05）；苜蓿植株中部磷含量（图3B）除在第1 茬的J4和J5处理、第2 茬的J3处理、第3 茬的J5处理外，其余各处理均为P1显著大于P0（P<0.05）；除第1 茬的J3、J4和J5处理、第2 茬的J3和J5处理及第3 茬的J2和J5处理外，苜蓿下部磷含量均表现为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）（图3C）。P0条件下，除第2 茬的J3处理和第3 茬的J2处理外，苜蓿上部磷含量均为J5处理显著大于其他各处理（P<0.05）；除第1 茬的J4和J5处理显著大于J1、J2和J3处理外（P<0.05），其余两茬的苜蓿中部磷含量均为J5处理显著大于其他各处理（P<0.05）；苜蓿下部磷含量为除第3 茬外，前两茬表现为J5处理显著大于其他各处理（P<0.05）。P1条件下，苜蓿各部位各茬次磷含量各不相同，无明显规律。苜蓿地上部不同部位磷含量由高到低依次为：上部>中部>下部。

2.4 不同菌磷处理下土壤有效磷含量

不同菌磷处理下土壤有效磷含量如表1 和图4 所示，除第3 茬非根际土壤有效磷和第2 茬根际土壤有效磷外，菌磷交互均对土壤有效磷含量有极显著影响（P<0.01）；除第3 茬非根际土壤有效磷含量对接菌的响应不显著外（P>0.05），接菌效应对各茬次根际和非根际土壤有效磷含量均有极显著影响（P<0.01）；施磷对土壤有效磷含量具有极显著影响（P<0.01）。

图4 不同处理下土壤有效磷含量Fig.4 Soil available phosphorus content under different treatments

相同接菌条件下，除第1 茬的J4处理与第3 茬的J1和J2处理外，非根际土壤有效磷含量均为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）；根际土壤有效磷含量均为P1处理显著大于P0处理（P<0.05）。P0条件下，第1 茬非根际土壤有效磷含量为J5处理显著大于J1处理（P<0.05），而J2、J3和J4间差异不显著（P>0.05），后两茬各接菌处理间也均不显著（P>0.05）；苜蓿根际土壤有效磷含量在第1 茬表现为J2处理显著大于其他各处理（P<0.05），第2 茬J2处理显著大于J1和J4处理（P<0.05），而 第3 茬 为J1处 理 显 著 小 于J3和J4处 理（P<0.05）。P1条件下，除第2 茬外，其余两茬的根际土壤有效磷含量均表现为J1处理显著大于其他各处理（P<0.05）；非根际土壤有效磷在P0条件下无明显规律。不同处理下根际土壤有效磷含量大于非根际土壤。

2.5 不同菌磷处理下紫花苜蓿的干物质产量和磷素利用效率

苜蓿干物质产量受接菌和施磷的影响显著（表1和表2）。相同接菌条件下，P1处理下的干物质产量均大于P0处理，但只在第1 茬的J1和J4处理、第2 茬的J3处理及第3 茬各处理下，P1处理与P0处理存在显著差异（P<0.05）。P0条件下，第1 茬干物质产量为J1、J2、J3和J4处理显著大于J5处理（P<0.05），第2 茬干物质产量虽仍表现为J1、J2、J3和J4处理大于J5处理，但仅在J1和J4处理表现为显著大于J5处理（P<0.05），第3 茬各接菌处理间均差异不显著（P>0.05）；P1条件下，第1 茬干物质产量均为J1、J2、J3和J4处理显著大于J5处理（P<0.05），而第2 茬各接菌处理间均差异不显著（P>0.05），第3 茬仅在J1处理显著大于J5处理（P<0.05）。在不同接菌比例下，P1处理的总苜蓿干物质产量相比P0处理增大了12.65%~19.85%，在J4P1处理下达到最大值，为49.31 g·pot-1。苜蓿磷素利用效率在不同接菌比例下表现不同，最大值出现在J4P1处理，为27.23%，相比磷素利用效率最低的处理（J5P1处理）提高了65%。

表2 不同处理下紫花苜蓿的干物质产量和磷素利用效率Table 2 Dry matter yield and phosphorus use efficiency of alfalfa under different treatments

2.6 相关性分析

苜蓿植株磷含量、根际土壤有效磷含量、非根际土壤有效磷含量、磷素利用效率和总干物质产量两两互为正相关（表3）。其中，总干物质产量与根际土壤有效磷含量和磷素利用效率呈极显著正相关（P<0.01），与非根际土壤有效磷含量呈显著正相关（P<0.05）；植株磷含量与根际土壤有效磷含量和磷素利用效率均呈极显著正相关（P<0.01），与非根际土壤有效磷含量呈显著正相关（P<0.05）；根际土壤有效磷含量与非根际土壤有效磷含量和磷素利用效率呈极显著正相关（P<0.01）；非根际土壤有效磷含量与磷素利用效率呈极显著正相关（P<0.01）。

表3 各指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of each index

2.7 隶属函数分析

为了综合评价各处理的优劣和避免单一指标分析的片面性，本试验选取了10 个处理的苜蓿植株磷含量、非根际土壤有效磷含量、根际土壤有效磷含量、干物质产量和磷素利用效率5 个指标采用隶属函数法进行综合评价。对10 个处理的隶属函数平均值进行排序（表4），J1P1处理的平均隶属函数值最大，为0.798，其次是J3P1和J4P1处理，平均隶属函数值分别为0.797 和0.762。

表4 不同处理下各指标隶属函数分析Table 4 Membership function analysis of each index under different treatments

3 讨论

磷作为植物生命活动中重要的营养因子，参与植物体细胞的构成和多种活动的代谢，与植物的产量密切相关。研究表明，适量施磷促进了作物的生长发育[18］。AMF 和PSB 都是解磷微生物的一大类群，解磷微生物可明显改善植物磷营养。根际互作（包括植物根系分泌物和土壤中真菌、细菌的互作）对植物养分的周转和获取至关重要[19］。AMF 与植物建立共生关系后，一方面，可以通过AMF 庞大的菌丝网络摄取土壤中的磷及其他矿质元素并运送至宿主植物中，从而促进植物生长[5，20］；另一方面，AMF 可通过影响根际土壤磷酸酶的活性及有机酸的组成和含量来活化土壤中的难溶性磷酸盐化合物[7，21］，且酸解过程中释放出的质子能够降低根际土壤pH，这进一步加强了螯合态磷酸盐的活化[7］。此外，PSB 与AMF 的合作显著增强了作物的生长[4，12］。

本研究结果表明，施磷和接菌对苜蓿植株磷含量的影响十分显著，相同接菌条件下，施磷处理的苜蓿相比于未施磷处理具有更高的植株磷含量，这是因为施磷扩大了植物吸收的磷源，而磷是光合作用的底物，施磷可通过增加苜蓿叶片的叶绿素含量和光合性能来进一步促进苜蓿干物质产量的形成[22］。可见，苜蓿磷含量与苜蓿干物质产量呈正相关。本研究中，相同施磷条件下，各茬次不同比例接种AMF 与PSB 对苜蓿磷含量的影响不尽相同，总体来看，J5处理下的植株磷含量显著大于其他处理，各器官及各部位的磷含量也表现出相同规律。这与植物的根际环境紧密相关，混接处理下的根际环境因比例不同其促生效应可能也存在较大差异。大多情况下，AMF 与PSB 有着良好的协同关系[23］，但在土壤C/P 较高时，PSB 也会与AMF 竞争土壤中的磷[24］。本研究结果表明，在AMF 与PSB 为7∶3 的混合比下（J5处理），苜蓿具有较大的磷含量，说明土壤C/P 较低，此时AMF 与PSB可能具有较好的协同关系。

本研究中，苜蓿花和叶的磷含量以及植株上部的磷含量较大，这主要是因为磷含量多存在于植物幼嫩的叶及根尖组织中，此外，在苜蓿由营养生长阶段进入繁殖生长阶段后，植物为了繁殖需要，植株体内的磷含量更多地由叶片向植物的繁殖器官（花）集中[25］，而茎秆本身纤维含量较多，磷素含量较少，且随着其生育时期的推进加剧了茎秆的木质化，这也解释了本试验中不同器官及不同部位磷含量的分布情况。

土壤有效磷指植物短期可直接吸收利用的磷，一般以HPO42-和H2PO4-形式为主[26］，是评价土壤供磷能力的重要指标[27］。研究表明，施磷能够提高土壤的有效磷含量，但施入土壤中的磷极易被吸附固定，导致土壤有效磷含量较低，有效磷的缺乏严重限制了作物的生长发育[1］。AMF 与PSB 等解磷微生物可以通过多种途径活化难溶性磷酸盐来提高土壤中磷的有效性，进而促进植物对土壤磷素的吸收利用及其产量的积累[28］。本研究结果表明，根际土壤有效磷含量和非根际土壤有效磷含量均与苜蓿总干物质产量呈极显著正相关。可见，苜蓿的干物质产量形成与土壤有效磷含量密切相关。土壤微生物磷是植物磷营养极其重要的来源，在土壤磷素的摄取和运输中发挥着重要作用[29］。研究表明，接种AMF 的根际土壤微生物量磷显著高于非根际土壤[7］。本研究结果表明，根际土壤有效磷含量明显大于非根际土壤有效磷含量，这与前人的研究结果一致。有研究发现，植物根际土壤解磷菌数量远大于其他区域土壤的数量[30］，这也佐证了本研究观点，说明根际解磷微生物在改善植株磷素吸收方面发挥着重要的作用。

干物质产量是苜蓿生产性能的直接体现，而磷素利用效率反映了作物将磷肥同化为自身营养物质时的效率，与作物产量的形成密不可分[31］。本研究中，磷素利用效率与苜蓿总干物质产量、植株磷含量、土壤有效磷含量均呈极显著正相关，说明AMF 与PSB 具有良好的协同效应，苜蓿能够最大程度地利用土壤磷素，改善其磷营养，进而提高苜蓿的磷素利用效率。尽管本试验中干物质产量和磷素利用效率均在J4P1处理达到最大值，但单个指标分析不足以涵盖所有信息，故对各指标进行了综合分析。本研究隶属函数分析结果得出：最大平均隶属函数值出现在J1P1处理，即在100 mg·kg-1的施磷条件下，以3∶7 的比例混合施入摩西管柄囊霉和巨大芽孢杆菌对苜蓿的促生作用较为显著。因此，在实际生产中，合理施用磷肥再配以解磷菌剂是提高苜蓿干物质产量和磷素利用效率的重要措施。

根际微生物间的互作关系与植物的生长密切相关，而这种关系（协同或者拮抗）又受到多种因素的影响，包括微生物的数量、种类、磷浓度等。尽管本试验对不同接菌比例下苜蓿的干物质产量及磷素空间分布特征进行了探讨，但由于本试验选用的是摩西管柄囊霉和巨大芽孢杆菌这两种菌，未在其他菌上进行验证，其他菌间是否出现协同效应尚不清楚。此外，土壤磷浓度对AMF 与PSB 的菌间关系也有显著影响，但磷如何影响菌间关系进而影响植物生长的具体机制仍有待进一步的深入研究。

4 结论

施磷可以明显促进紫花苜蓿的生长。不同比例接种AMF 和PSB 对苜蓿生长的影响显著。苜蓿植株磷主要集中在上部，在器官上主要倾向于向花和叶分布，土壤有效磷主要集中在根际区域。在不施磷条件下，5∶5 的AMF 与PSB 的双接菌比例能够最大程度提高苜蓿的生产；在100 mg·kg-1的施磷（P2O5）条件下，以3∶7 的比例混合施入AMF 和PSB，能够较大程度改善苜蓿的磷营养，从而提高苜蓿的干物质产量和磷素利用效率。