不同产地白术饮片HPLC指纹图谱研究

侯晓杰 郑英 李玮 张建锋

【摘 要】 目的：通过对不同产地白术饮片研究，建立白术饮片高效液相指纹图谱。方法：采用HPLC法。色谱柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0～10 min，50%～70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速为1.0mL·min-1，柱温为25 ℃，白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ检测波长为220 nm，白术内酯Ⅱ检测波长为276 nm，进样量20 μL。以2号峰白术内酯Ⅲ为参照， 记录12批次白术饮片的HPLC图谱，然后将其导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012版》（国家药典委员会），采用指纹图软件确定共有峰。结果：建立12批白术饮片的HPLC指纹图谱，标定12个共有峰，相似度均大于0.90。经验证，与对照指纹图谱具有较好的一致性。结论：研究建立HPLC指纹图谱可用于白术饮片质量控制方法，同时也为白术饮片质量评价提供科学依据。

【关键词】 白术饮片；高效液相色谱法； 指纹图谱；白术内脂

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】A    【文章编号】1007-8517（2023）14-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202314011

Abstract：Objective To establish a high performance liquid fingerprint of Atractylodes macrocephala.Methods HPLC method was used. Column： Agilent C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），mobile phase： acetonitrile-water，gradient elution （0-10 min，50%-70% A;10-20 min，70%-80% A） ，20～30 min; 80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），the flow rate is 1.0 mL·min-1，the column temperature is 25 °C，atractylenolide I，atractyl lactone III The detection wavelength was 220 nm，the atractylenolide II detection wavelength was 276 nm，and the injection volume was 20 μL. Taking the bergenin as a reference，the HPLC chromatogram of 12 batches of decoction pieces was recorded，and then introduced into the Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation Software System 2012 Edition （National Pharmacopoeia Commission） to determine the common peak.Results There were 12 common peaks in the HPLC fingerprints of 12 batches of Atractylodes macrocephala. The similarity was greater than 0.90. It has been verified that it has good consistency with the control fingerprint.Conclusion The HPLC fingerprint of this study can be used to control the quality control of Atractylodes macrocephala L.，and also provide reference for the quality evaluation of Atractylodes Rhizome.

Keywords：Atractylodes Macrocephala; High Performance Liquid Chromatography; Fingerprint; Atractylodes

白術为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎。临床上白术炮制品主要有麸炒白术、土炒白术和焦白术等饮片，麸炒白术表面焦黄色或黄棕色，偶见焦斑，略有焦香气，具有缓和燥性、健脾消胀之功效，用于脾胃不和、运化失常、倦怠乏力和表虚自汗等症状［2-4］；土炒白术表面杏黄土色，附有细土末，有土香气，具有补脾止泻之功效，用于脾虚食少、泄泻便溏、胎动不安等症状［5-7］；焦白术不规则厚片，表面焦褐色，断面焦黄色，质松脆，略有焦香气，焦白术具有补气健脾、涩肠止泻的作用，主要用于慢性寒性腹泻［8-10］。因此，课题对不同区域白术饮片开展研究，建立指纹图谱共有模式，用于白术饮片质量控制，为白术质量评价提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UltiMate3000高效液相色谱仪（赛默飞）；JT5003千分之一电子天平（余姚市金诺天平仪器公司）；ME204E万分之一电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），AUW220D十万分之一电子分析天平（苏州岛津仪器有限公司）；LDP-150高速万能粉碎机（浙江永康市红太阳机电有限公司）；DZ-2BC真空干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 材料 白术内酯Ⅰ对照品（批号：111975-201501）、白术内酯Ⅱ对照品（批号：111976-201501）、白术内酯Ⅲ对照品（批号：111978-201501）均购于中国食品药品检定研究院，以上对照品均供含量检测用。甲醇（色谱纯，天津科密欧公司）；乙腈（色谱纯，天津科密欧公司）；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

收集不同产地的白术饮片，经贵州中医药大学生药教研室魏升华教授鉴定为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.经加工制成的饮片。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：乙腈-水，梯度洗脱（0～10 min，50%-70%A；10～20 min，70%～80%A，20～30 min；80%～92%A，30～38 min，92%～100%A），流速为1.0 mL.min-1，柱温为25 ℃，白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ检测波长为220 nm，白术内酯Ⅱ检测波长为276 nm，进样量20 μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称定白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ对照品适量，用甲醇溶解配制成质量浓度浓度分别为1.20 μg/mL、4.40 μg/mL、2.22 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称定白术饮片粉末（过3号筛）约0.5 g，置具塞锥形瓶中，准确加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，取出，放置至室温，再次称定质量，用甲醇补足质量，摇匀，过滤，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度试验 取白术药材粉末依照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.3%和1.9%，表明该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取白术药材粉末6份，并依照“2.2.2”项下方法制备供试品平行溶液，按“2.1”项色谱条件下分别进样测定，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.7%和2.2%，表明此方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取白术药材粉末依照“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，以2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录共有峰的相对保留时间和峰面积，其结果分别为1.6%和2.1%，表明24 h内样品溶液的成分稳定。

2.4 白术HPLC指纹图谱的建立及技术参数

2.4.1 白术HPLC指纹图谱的比较和分析 采集于我国不同地区的12批白术饮片，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，记录HPLC指纹图谱，然后将12批饮片的指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012版（国家药典委员会）。进行色谱峰匹配，并生成对照指纹图谱，以建立的共有模式为参照图谱计算1～12批样品的相似度。

2.4.2 色谱峰指认 对不同的供试品色谱图的检测结果进行比较，本试验标定了12个指纹图谱中的共有峰，如图1所示，与混合对照品的指纹图谱进行比对，确认了2号峰白术内酯Ⅲ、5号峰为白术内酯Ⅰ、8号峰为白术内酯Ⅱ。从相似度数据（表2）和图2中可以看出不同地区的白术饮片相似度在0.963～0.999之间，均大于0.9，说明不同产地的白术所含化学成分大致相同。

2.4.3 白术参照峰的标定 通过对12批不同产地白术饮片指纹图谱的测定结果进行比较，确定了12个色谱峰为共有峰，并选择了2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰。在白术药材指纹图谱中白术内酯Ⅲ保留时间适宜，峰形较稳定，白术内酯Ⅲ也是白术药材的主要成分之一，并且在所有白术饮片中为共有峰，因此选定白术内酯Ⅲ为参照峰。

3 讨论

3.1 检测波长的选择 本试验利用紫外-可见分光光度计对白术样品溶液进行全波长扫描，经波长扫描发现白术样品溶液分别在243 nm，292 nm，376 nm 3个波长处有吸收。并利用高效液相色谱液对各波长进行考察。发现当检测波长为243 nm时，基线较稳定，呈现的吸收峰较多，峰面积相对较大，分离度好，峰形对称。本试验通过全波长扫描得到，样品在3个波长下有吸收，分别对3个波长进行比较，最终选择243 nm作为白术指纹图谱检测波长。

3.2 洗脱方式的选择 在实验过程中，选择等度洗脱和梯度洗脱两种方式进行研究， 当使用等度洗脱，色谱峰在分离过程中分离度不理想，所以考虑使用梯度洗脱，以色谱峰的分离度和保留时间为指标，确定最终洗脱方式为梯度洗脱。

3.3 提取溶剂的选择 取白术粉末约1.0 g，精密称定，分别以甲醇和乙醇进行超声提取。以考察甲醇、乙醇作为提取的溶剂对白术样品溶液的指纹图谱，结果两种提取溶剂对白术样品差异不明显，且乙醇毒性较小，故本试验选择用乙醇进行提取。

3.4 提取溶剂质量分数的选择 本试验分别以100%、80%、60%乙醇作为溶剂考察对白术指纹图谱的影响。显示用100%乙醇作提取溶剂时，峰分离度较好，吸收较大，信息量大，故本试验选择用100%乙醇进行提取。

3.5 料液比的选择 本试验对比不同料液比的提取溶剂对白术进行提取，分别考察料液比为1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10对白术样品指纹图谱的影响。发现当料液比为1∶20时，峰分离度较好，吸收较大，信息量大，故选择1∶20为最佳料液比。

3.6 提取时间的选择 为了得到较好的提取效果，经查阅相关文献资料［7-8］，本试验分别考察超声提取60 min、40 min、20 min对白术样品的影响，当提取时间为40 min时峰分离度较好，吸收较大，信息量大，本试验以超声40 min来进行提取。

3.7 提取方法的选择 以文献中查阅的方法为依据［9-10］，分别进行回流提取、超声提取两种方法考察，分别比较两种提取方法下指纹图谱，结果显示，两种提取方法对白术指纹图谱色谱图无明显差异，为了操作方便，节约时间故选择超声提取。在研究白术指纹图谱提取方法时，分别从样品提取方法、提取溶剂、溶剂比例、提取时间进行了考察，通过试验结果，最終确定提取方法为加入100%乙醇20 mL超声40 min。

3.8 指纹图谱结果分析 通过建立白术饮片指纹图谱，对12批白术饮片指纹图谱进行分析研究，发现白术饮片HPLC共有峰的相对峰面积和共有保留时间具有较好稳定性，12批饮片相似度均大于0.90，说明虽然产地不同，生长环境多样化，但是白术的质量相对稳定。

综上，研究根据市场调研情况，对全国白术的道地产区分别采集样品进行研究，确保研究样品具有道地性、真实性和代表性，全面系统考察了检测波长、洗脱方式、提取溶剂、提取时间和料液比等条件，保证建立的方法较好的适用性和科学性。通过HPLC法对全国不同区域白术饮片进行研究，建立白术饮片指纹图谱研究方法，采用指纹图谱软件标定12个共有峰，并选择2号峰白术内酯Ⅲ作为参照峰，记录12批次白术饮片的HPLC图谱，其相似度均大于0.90，说明该方法具有较好的专属性、重现性、稳定性和可控性，可作为白术种质资源、开发应用、加工方法和饮片标准等研究提供研究基础和技术方法，并能更加系统全面为白术相关的质量评价提供科学依据。

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（收稿日期：2022-11-05 编辑：陶希睿）