东北传统甜酸茶中乳酸菌分离鉴定及益生特性研究

徐世航，郑 妍，岳松烨，朱琼瑶，赵 宇，边 鑫

（哈尔滨商业大学，黑龙江哈尔滨 150028）

甜酸茶是发源于中国北方的一种以小米和大豆等谷物为原料经自然发酵制成的饮品。甜酸茶的主要功能菌种是乳酸菌，大部分乳酸菌在人体内能发挥益生作用，促进人体健康[1-2]。因此，从甜酸茶中分离筛选乳酸菌，将有助于益生菌资源的开发。本文采用传统分离法从甜酸茶中得到乳酸菌，并对其进行分子生物学鉴定和生理生化鉴定，同时评价乳酸菌的安全性及胃肠道耐受能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜酸茶（市售）；MRS 液体培养基、琼脂、M17培养基、革兰氏染色试剂盒，黑龙江久丰生物公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、牛胆盐，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；无水乙醇、PBS 缓冲液等其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

全自动高压灭菌锅，上海力申科学仪器有限公司；DL201 型恒温自动干燥箱，天津市实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 甜酸茶中的乳酸菌分离

将甜茶和酸茶样品用0.9%的生理盐水稀释10倍，将各自的溶液涂在固体MRS 平板上，在37 ℃下培养48 h。从平板上选择不同形态和大小的单个菌落，将其刮除并清洗数次，选择符合优势菌形态特征的菌落进行液体培养，并将其置于-80 ℃的甘油冷冻管中保存，以便进一步研究。

1.3.2 乳酸菌的形态

采用革兰氏染色试剂盒将分离后待检测的菌株置于载玻片上进行染色，在显微镜下观察菌株形态，根据形态判断菌株为革兰氏阳性菌（G+）或革兰氏阴性菌（G-）。

1.3.3 生理生化鉴定

将乳酸菌的菌液接种到不同培养基上，在无菌条件下进行培养，采用生理生化试剂盒对乳酸菌进行产过氧化氢酶、产硫化氢、葡萄糖产气、葡萄糖产酸、淀粉水解和糖发酵能力等生理生化鉴定，根据鉴定结果初步确定菌株种属。

1.3.4 分子学鉴定

利用16S rDNA 基因序列研究方法对纯化后的菌株进行分子学鉴定，将16S rDNA 测序并拼接所得的序列导入NCBI，进行BALS 比对，所得结果导出后，应用MEGA 5.1 软件构建系统进化树进行分析。

总而言之，数学思想属于一项系统性的工程，可能会受到多种因素的影响。小学数学教师要做好课前准备、课中带领学生自主探究、课后巩固内化工作，随时对教学规律进行探索，在日常教学过程中渗透数学思想，提高学生的数学成效。

1.3.5 优势菌安全性评价

（1）抗生素抗性试验。将筛选获得的两株乳酸菌菌株接种在3%的MRS 液体培养基中，37 ℃下培养24 h，将0.1 mL 细菌溶液均匀地涂布在装有MRS 培养基的琼脂平板上。将含有标准剂量抗生素的3 块纸片放在MRS 培养基中，37 ℃下培养24 h。监测抑制周期的出现，根据美国国家临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）的标准，用抑制周期的直径确定细菌是否对抗生素有抗性。该检测中使用的抗生素是氨苄西林、头孢噻吩、环丙沙星、氯霉素、头孢曲松、头孢噻肟、红霉素、庆大霉素、林可霉素、青霉素、利福平、复方新诺明和四环素[3]。

（2）溶血试验。分别对筛选获得的两株乳酸菌菌株取样，以3%的浓度在MRS 液体培养基中培养，37 ℃下培养24 h。培养结束后在血琼脂培养基上打3 个孔并向每个孔中加入100 μL 菌液，在37 ℃下培养48 h，查看有无溶血圈，从而判断对人体健康的影响程度。

1.3.6 模拟胃肠道消化试验

乳杆菌对人工模拟胃液的耐受性参照程爽等[4]和MARAGKOUDAKIS 等[5]的方法进行评价。取1 mL 乳杆菌菌液，在10 000×g、4 ℃条件下离心5 min 后，弃上清收集菌体，用PBS 缓冲液（pH=7）洗涤两次，沥干后备用。调节HCl 溶液的pH 值为2.5，分别加入浓度为0.3 mg·mL-1的胃蛋白酶，配制成模拟胃液。调节PBS 缓冲液的pH 值为6.8，加入浓度为0.1 mg·mL-1的胰蛋白酶，配制成模拟肠液。将PBS 缓冲液调节成pH 值为8.0 的溶液，加入胆盐配制成浓度为0.3%的胆盐溶液。取1 mL 模拟胃液、1 mL 模拟肠液和1 mL 胆盐溶液分别加入盛有菌体的离心管中，充分混匀后，37 ℃下培养，分别在培养1 h、2 h 和3 h 时取样，涂布于MRS 琼脂培养基进行平板计数，计算乳杆菌菌液浓度。

1.3.7 数据分析

使用Origin 2019 和SPSS 22 进行数据处理、分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 菌株的初筛鉴定结果

图1 初筛菌株BIAN-tsc1 的形态学观察及显微观察

图2 初筛菌株BIAN-tsc2 的形态学观察及显微观察

2.2 生理生化试验结果

通过过氧化氢酶、硫化氢、葡萄糖产气、葡萄糖产酸、淀粉水解和糖发酵试验分析了菌株BIANtsc1 和BIAN-tsc2 的生理生化特性，结果见表1 和表2。由表1 可明显看出两菌株的过氧化酶试验、硫化氢试验和葡萄糖产气试验结果显示均为阴性，而葡萄糖产酸试验均为阳性，该结果与乳酸菌的生理生化鉴定结果相同。淀粉水解试验结果显示，BIANtsc1 为阳性，而BIAN-tsc2 为阴性，说明BIAN-tsc1可能有产淀粉酶能力。

表1 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的部分生理生化特性

表2 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的糖发酵特性

由表2 可明显看出这两种菌株在培养过程中都可以很好地利用果糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖和核糖，但只有菌株BIAN-tsc1可以利用阿拉伯糖和木糖，该对比符合乳酸菌的糖发特性，说明两种菌株都能利用多种糖类作为碳源生长。

2.3 初筛菌株的分子生物学鉴定结果

对两株菌株进行16S rDNA 测序后进行同源性比对，结果显示，菌株BIAN-tsc1 在NBCI 数据库中比对后的同源性为100%的前20 的菌种均为植物乳杆菌。选取序列同源性较高的菌株与菌株BIAN-tsc1进行系统发育树的构建，见图3。菌株BIAN-tsc1 与植物乳杆菌菌株在同一个分支中，且它们之间的遗传距离远小于其他菌株，故确定菌株BIAN-tsc1 为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

图3 菌株BIAN-tsc1 的系统发育树

菌株BIAN-tsc1 在NBCI 数据库中比对后的同源性为100%的前20 的菌种均为棒状乳杆菌。选取序列同源性较高的菌株与菌株BIAN-tsc2 进行系统发育树的构建，见图4。菌株BIAN-tsc2 与棒状乳杆菌菌株在同一个分支中，且它们之间的遗传距离远小于其他菌株，故确定菌株BIAN-tsc2 为棒状乳杆菌（Lactobacillus coryniformis）。

图4 BIAN-tsc2 的系统发育树

2.4 乳酸菌安全性评价

2.4.1 抗生素敏感性

菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 对所选抗生素的抗性试验结果见表3。根据NCCLS 的标准对两种菌进行判断，两种菌株对抗生素的抗性试验表明它们对大多数抗生素不敏感，可知这两种菌有较高的安全性。

表3 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的抗生素抗性

2.4.2 溶血性

如图5 所示，将菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 置于37 ℃条件下培养48 h 后，观察血琼脂培养基上的3 个穿孔，发现每个穿孔附近一周均没有出现溶血圈，说明两个菌株均不具有溶血性。该安全评估试验结果表明自然发酵的甜茶和酸茶样品中菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 对人体健康无害，可用于食品发酵。

图5 BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 的溶血作用情况

2.5 乳酸菌的益生特性

人体胃内的pH 值为2.5 左右，食物在胃中的停留消化时间为2 ～4 h，乳酸菌进入消化道，往往由于胃液、肠液和胆盐的极端环境导致活菌数大量下降，无法在体内发挥益生作用。因此，本研究考察3 h内BIAN-tsc1 菌和BIAN-tsc2 菌的存活情况，结果见表4。两株菌在pH=2.5 的人工模拟胃液、pH=6.8 的肠液和0.3%的胆盐溶液中培养3 h 后，其活菌数几乎没有变化，始终保持在7 logCFU·mL-1左右，说明菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 对胃液和肠液具有良好的耐受性，可在小肠下部或大肠中发挥其功能性。

表4 菌株BIAN-tsc1 和BIAN-tsc2 对人工模拟胃液的耐受性

3 结论

从东北传统甜酸茶中分离出两株乳酸菌BIANtsc1 和BIAN-tsc2，经生理生化及16S rDNA 鉴定确定两株菌分别为植物乳杆菌和棒状乳杆菌。BIANtsc1 和BIAN-tsc2 能利用大多数糖作为碳源进行生长增殖，其中，BIAN-tsc1 具有降解淀粉的能力。通过对抗生素和溶血性评价，确定BIAN-tsc1 和BIANtsc2 对大多数抗生素均不敏感，没有溶血作用，且具有较好的胃肠道耐受能力。