实时荧光PCR 法检测芝麻酱中的芝麻成分

李 娟，陈茵茵，梅 岩，陈雪华，王 达，黄嘉文

（1.广东省食品药品职业技术学校，广东广州 510000；2.广东省食品检验所，广东广州 510000）

芝麻又称胡麻，既是油料作物，又可直接食用。芝麻酱是由芝麻炒熟、磨碎制成，其香味浓郁，色泽金黄，口感细滑，是广大消费者喜爱的一种调味品[1]。芝麻酱的营养丰富，含有不饱和脂肪酸、蛋白质、维生素E、矿物质、铁等对人体有益的营养物质[2]。芝麻酱的制作工艺简单，不需要特殊的大型设备，但因市场准入门槛低等使得生产企业生产的产品质量相差很大，各种掺假方式层出不穷，如掺入其他油料作物、用淀粉香精调制等[3]。因此，芝麻酱作为消费者生活中必不可少的调味品，其掺假检测非常必要。

目前，芝麻酱的掺伪鉴定还未有相关标准出台，最常用的芝麻酱掺伪鉴别方式是感官鉴别，对其色、香、味、形进行判定，但一般消费者并不具备相关的知识导致难以分辨是否掺伪。国内学者对于芝麻酱的研究也较少，其鉴定指标/技术有采用色谱法测定脂肪酸、采用气质联用技术测定特征风味物质[4]、分子生物学技术PCR 法等[5]。分子生物学技术现在已广泛应用于多种动植物产品掺假鉴定中，本项目应用的实时荧光PCR 技术可直接判读芝麻酱产品是否含有芝麻源性成分或其他标签未标识的其他源性成分，灵敏度高、操作简便。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荧 光PCR 试 剂：Takara Premix Ex Taq（Probe qPCR）RR390A，分析纯；异丙醇，分析纯；DNA提取试剂：QIAGEN DNeasy mericon Food Kit（Code No.69514），分析纯，德国QIAGEN 公司；引物，生工生物上海有限公司。

Bio-rad CFX96 荧光定量PCR 仪，美国Bio-rad公司；Biospec-nano 核酸蛋白测定仪，日本岛津公司；1300 系列A2 级别生物安全柜，美国Thermofisher 公司；Sorvall ST 8 离心机，美国Thermofisher 公司。

1.2 实验方法

将芝麻酱样品进行均质，按照优化后的植物DNA 提取流程或成品的试剂盒DNA 提取流程进行DNA 的提取，之后以提取的DNA 为模板，采用2S albumim mRNA 基因的特异性引物、探针进行实时荧光PCR 检测，观察是否出现实时荧光PCR 的增幅现象，判断待检样品中是否含有芝麻源性成分，实现芝麻源性成分的鉴定。

1.2.1 样品前处理

将芝麻酱样品中析出的上层油质去除，尽量去除干净，否则影响芝麻酱DNA 的提取，用洁净的玻璃棒搅拌均匀，取芝麻酱样品约500 mg 置于离心管中，4 ℃冷冻离心，去上清留沉淀，置于-20 ℃冰箱中保存，以备下一步进行核酸提取。

1.2.2 DNA 提取

试剂盒优化法：①取经过前处理后的样品约1 000 mg，加入等体积的异丙醇溶液，轻轻涡旋振荡；②振荡后将其置于4 ℃冰箱中静置30 min，后取出于4 ℃冷冻离心；③按照商业化DNA 提取试剂盒说明书中的要求进行DNA 提取。提取过程中设置提取对照，以灭菌去离子水代替样品进行DNA 提取。

1.2.3 DNA 浓度测定

采用Biospec-nano 核酸蛋白分析仪对提取的DNA 进行浓度测定。

1.2.4 实时荧光PCR 扩增及其质控设置

芝 麻 源 性 成 分 检 测2S albumim mRNA基因的特异性引物探针序列， 上游引物：CCAGAGGGCTAGGGACCTTC； 下 游 引 物：CTCGGAATTGGCATTGCTG； 探 针 序 列：FAMTCGCAGGTGCAACATGCGACC- TAMRA。

芝麻源性成分检测实时荧光PCR 反应体系采用25 μL 反应体系，PCR 缓冲液加入2.5 μL，其工作浓度为10 倍Buあer；上下游引物、探针各加1 μL，其工作浓度均为10 μmol·L-1；dNTPs 加入2 μL，其工作浓度均为10 μmol·L-1，Taq DNA 聚合酶加入0.2 μL，其工作浓度为2.5 U·μL-1；DNA模板加入量为10～100 ng，最后用灭菌去离子水补足25 μL 反应体系。

芝麻源性成分检测实时荧光PCR 反应程序：50 ℃/2 min，1 个循环；95 ℃/15 min，1 个循环；95 ℃/15 s，60 ℃/1 min，40 个循环；在每次循环退火时收集荧光信号。反应参数可根据基因扩增仪型号以及所使用试剂的不同进行适当的调整。

以芝麻中提取的DNA 为阳性对照，以花生提取的DNA 为阴性对照，以灭菌水为空白对照，以水为样品进行提取作为提取过程的对照。

1.2.5 荧光PCR 扩增结果判断与表述

阈值的设定根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct 值不出现任何数值为准。

（1）各对照结果应符合以下要求。①阴性对照：无荧光增幅现象。②提取对照及空白对照：无荧光增幅现象。③阳性对照：有明显的荧光增幅现象。④内参照：有明显的荧光增幅现象。⑤以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。

（2）结果判定。①同时进行的内参照、阴性、阳性、空白和提取对照实验结果正常，检测样品无荧光增幅现象，Ct 值＞40.0，判断被检样品阴性，未检出芝麻源性成分。②同时进行的内参照、阴性、阳性、空白、提取对照实验结果正常，检测样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct 值＜35.0，判断被检样品阳性，检出芝麻源性成分。③同时进行的内参照、阴性、阳性、空白、提取对照实验结果正常，且检测样品荧光增幅曲线的Ct值在35.0～40.0，则应重新进行实时荧光PCR反应。再次扩增出的结果Ct 值仍在35.0 ～40.0，可判断被检样品可疑，否则可判断被检样品阴性。

1.2.6 方法特异性研究

在芝麻酱产品中可能会掺杂花生成分[1]，为验证该方法的特异性，以花生样品提取的DNA 为模板，以本研究中芝麻的上下游引物、探针进行扩增，查看扩增结果是否出现非特异性扩增。

1.2.7 方法检出限研究

样品中若芝麻成分含量少，提取到的DNA 浓度过低，可能会导致检测不出芝麻源性成分，因此需要对本研究中的上下游引物、探针进行检出限的验证。对芝麻样品提取的DNA 进行稀释，浓度分别为提取后浓度的10%、1%、0.1%、0.01%，以不同比例稀释后的DNA 为模板进行实时荧光PCR 扩增。

2 结果与分析

2.1 方法特异性验证结果

从图1 中看出，以花生样品提取的DNA 为阴性对照进行扩增后，无荧光增幅现象，说明本研究中应用的上下游引物、探针具有特异性，可特异性扩增芝麻源性成分。

图1 芝麻源性成分2S albumim mRNA 基因检测

2.2 方法检出限验证结果

对芝麻样品提取的DNA 进行稀释后，浓度分别为原浓度的10%、1%、0.1%、0.01%，以此为模板扩增，结果见图2。从图中可看出，在DNA 浓度为0.01%时仍有荧光增幅现象，且Ct 值＜35，说明该方法的最低检出限（LOD）为0.01%。

图2 芝麻源性成分检测检出限

2.3 市售样品检测结果

超市购买芝麻酱待检品3 份，产品均有明确的标签标识，其中2 份标识含有芝麻源性成分和花生源性成分，一份标识仅含有花生源性成分。用本方法进行芝麻源性成分的鉴定，结果见图1 及表1，结果显示同时进行的阴性、阳性、空白、提取对照实验结果正常，两份样品能检测出芝麻源性成分，标签仅含花生源性成分的样品未检出芝麻源性成分。

表1 实际样品检测结果

3 结论

本研究建立了利用实时荧光PCR 法对芝麻源性成分进行检测的方法，并利用该方法对市售样品进行了检测。经过验证，该方法的特异性及检出限均能满足检测要求，市售样品检测结果均符合产品标签，说明该方法检测结果可靠。