多种维生素片中维生素K2 含量检测研究

杨菊辉

（哈药集团制药六厂，黑龙江哈尔滨 150056）

维生素K 是一类具有叶绿醌生物活性的萘醌基团的衍生物。维生素K1是食物中维生素K 的重要来源，存在于绿色植物中；维生素K2在动物体内具有生物活性，主要由肠道细菌合成，具利尿、强化肝脏的解毒功能、降血压的作用，多用于维持凝血时间、加速凝血、治疗维生素K 缺乏引起的出血症，可以预防治疗骨质疏松症，增强骨密度，防止骨折。1995 年，日本首次将维生素K2应用于临床治疗骨质疏松[1]。2009 年，欧盟通过了2009/345/EC 决议，批准维生素K2作为食品配料，并投放市场[2]。美国药典委员会发布的《2015 年膳食补充剂纲要》支持维生素K2开发的准入标准[3]。2016 年，我国卫计委发布《关于海藻酸钙等食品添加剂新品种的公告（2016年第8 号）》将维生素K2（MK-7）列入了食品营养强化剂新品种[4]。

基于维生素K2的生理功能，人们越来越重视它的摄入，目前国内外尚没有关于食品中维生素K的标准检验方法发布，国内相关公告中提供了维生素K2含量的测定方法，我国卫计委2016 年第8 号公告、国家卫健委2019 年第6 号公告、国家卫健委2020 年第9 号公告《蝉花子实体（人工培植）等15 种“三新食品”的公告》分别批准来自发酵法工艺和合成法工艺生产的维生素K2（MK-7）作为营养强化剂使用，原国家食药总局2016 年第205 号公告规定了保健食品中维生素K2的使用范围和使用量。《食品安全国家标准 运动营养食品通则》（GB 24154—2015）中规定了运动后恢复类、骨关节恢复类运动营养食品中可选择添加维生素K2，其检测方法参考使用《食品安全国家标准 食品中维生素K1的测定》（GB 5009.158—2016）中的高效液相色谱-荧光检测法，此方法简便、灵敏度高、选择性高。维生素K2常见的检测方法主要包括液相色谱紫外检测法[5]、液相色谱荧光检测法[6]、液相色谱串联质谱联用法[7]等。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

异丙醇、色谱醇，天津市光复科技发展有限公司；甲醇，色谱纯，北京迪马科技有限公司；维生素K2对照品（批号R080LD，97.8%），执行美国药典标准。

分析天平，MS205D；高效液相色谱仪，e2695泵，2489 检测器，美国Waters 公司；数控超声波清洗器，KQ-100DE，昆山市超声仪器有限公司；离心机，KL04A；湖南凯达科学仪器有限公司。

1.2 标准溶液的配制

100 μg·mL-1维生素K2标准储备液：取维生素K2对照品，精密称定10 mg，置于100 mL 棕色容量瓶中，加入异丙醇，充分溶解，定容至刻度线，0 ～4 ℃保存。

5 μg·mL-1维生素K2标准工作液：精密吸取5 mL维生素K2标准储备液，置于100 mL 棕色容量瓶中，加异丙醇稀释，定容至刻度线，摇匀。

1.3 试样制备

取20 片多种维生素片，研细，混匀，称取约6 g的试样，精密称定，置于50 mL 离心管中，加异丙醇20 mL，涡旋3 min，温度≤50 ℃超声30 min，冷却至室温，3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，用0.45 μm 滤膜过滤，得供试品溶液，操作过程注意避光。

1.4 色谱条件

色谱柱：C18ODS 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），内装C18填充物；检测器：紫外检测器，波长254 nm；色谱流动相：甲醇；流速：1.0 mL·min-1；进样量：50 μL；柱温：50 ℃。

1.5 测定

分别注射50 μL 维生素K2标准工作溶液、50 μL供试品溶液，得到标准品和供试品溶液中维生素K2峰面积，按外标法计算。

1.6 计算公式

样品中维生素K2的计算公式为

X=C×V/M（1）

式中：X为样品中维生素K2的含量，μg；C为供试品中维生素K2的质量浓度，μg·mL-1；V为供试品的体积，mL；M 为供试品的质量，g。

2 结果与分析

2.1 专属性

取阴性空白辅料（不含有维生素K2），按供试品同法处理得空白溶液。取空白溶液、标准工作液、供试品溶液，按1.4 色谱条件检测。空白辅料在主峰位置无吸收，主成分峰色谱前后杂质分离良好，该方法专属性良好。

2.2 线性关系与范围

精密吸取维生素K2标准储备液，按标准液25%、50%、100%、150%和200%浓度水平制备梯度曲线，依法测定，以不同稀释倍数的溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，线性回归处理，计算回归方程及线性相关系数，结果见表1。线性相关系数0.998 2，在1.25 ～10.00 μg·mL-1线性关系良好。

表1 维生素K2 含量测定方法线性关系试验统计结果

2.3 准确度

取维生素K2对照品与试样样品，按50%加标回收法平行制备6 份供试品溶液，依法测定，计算回收率，计算相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），结果见表2，方法回收率良好。

表2 维生素K2 含量测定方法准确度试验结果

2.4 精密度

2.4.1 重复性精密度

取试样样品6 份，按1.3 平行制备供试品溶液，分别检测维生素K2的含量，计算得RSD 为1.69%，详见表3。

表3 维生素K2 含量测定方法重复性试验结果

2.4.2 中间精密度

同一样品，由2 名实验人员在不同日期分别取样6 份，使用不同的高效液相色谱仪（岛津）依法测定维生素K2含量，计算RSD 值，结果见表4。计算12 个检验结果的相对标准偏差来验证中间精密度，结果为1.70%，表明检测方法的重复性和精密度良好。

表4 维生素K2 含量测定方法中间精密度试验结果

2.5 检出限与定量限

检出限：折到3 倍信噪比时的浓度；定量限：折到10 倍信噪比时的浓度。本方法检测多种维生素片中维生素K2检出限为0.06 μg·g-1，定量限为0.20 μg·g-1。

2.6 稳定性

取2.4.1 中样品，分别于0 h、12 h、24 h 进样，考察样品溶液稳定性。由表5 可知，RSD 值为0.63%，说明本品测定方法耐用性良好。

表5 维生素K2 含量测定方法溶液稳定性试验结果

2.7 试样验证

按照1.3 制备两个样品1#，2#，按此法检测维生素K2含量，结果见表6。经过验证，试样检测的精密度符合要求。

表6 试样中维生素K2 含量结果

2.8 系统重复性、标准物质、试样的色谱图

按照1.4液相色谱条件检测样品和标准工作溶液，以色谱峰外标法进行定量，系统适用性重叠色谱图见图1，标准物质色谱图见图2，试样色谱图见图3。

图1 系统适用性重叠色谱图

图2 标准物质色谱图

图3 试样色谱图

3 结论

本研究建立了高效液相色谱法检测多种维生素片中维生素K2含量的方法，本方法专属性良好，在1.25 ～10.00 μg·mL-1线性关系良好，线性相关系数为0.998 2，重复性实验相对标准偏差为1.69%，50%加标回收率为92.21%～100.22%，检出限为0.06 μg·g-1，定量限为0.20 μg·g-1。该方法精密度和准确度良好，灵敏度高，分离度好，可用于多种维生素片中维生素K2含量的研究，本文为保健食品中维生素K2的检测、质控、监管提供了技术支撑。