雄黄抗肿瘤作用及分子机制研究进展

赵新月 ，田颖颖 ，左泽平 ，刘闯 ，于尚玥 ，李依林 ，田时秋 ，裴海鸾 ，王志斌，

1.北京中医药大学中药学院，北京 100029； 2.北京同仁堂科技发展股份有限公司，北京 100079

国际肿瘤研究所（International Agency for Research on Cancer）发布的GLOBOCAN 2020癌症发病率和病死率数据统计提到，预计2040年全球癌症患者将达2 840万例[1]。根据全球疾病目前的排名和发展趋势，癌症可在本世纪超过心血管疾病，成为大多数国家公民过早死亡的主要原因[2]。尽管全球医疗手段的发展已使癌症治疗取得巨大进步，癌症的发展势头有所放缓[3]，但恶性肿瘤依旧是许多国家公民的第二大死亡原因。目前，外科手术和化疗是主要的治疗手段，但由于术后并发症、化疗药物毒性及不良反应，治疗效果尚不理想。中医药作为我国防治肿瘤的重要方法，具有整体性、平衡性、多系统和多靶点的特点[4]，以扶正、解毒、化痰、活血化瘀等治法抑制肿瘤细胞生长[5]。寻找新型、低毒、高效的抗肿瘤药物已成为现代医学和中医药领域亟待解决的关键问题。

雄黄始载于《神农本草经》，为硫化物类矿物雄黄族雄黄，主含四硫化四砷（As4S4）。在中医药领域，不同形式的砷化物包括雌黄（As2S3）和亚砷酸盐（As2O3/ATO）被广泛应用，我国古代用其治疗牛皮癣、梅毒、风湿病、蛇虫咬伤、惊痫及疟疾等。现代医药领域已有60多种砷剂应用于临床[6]，但因不良反应问题，砷剂的抗肿瘤研究曾一度放缓[7]。直至ATO成功治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的研究发布，方突显了砷类药物作为抗癌剂的药用价值[8-10]。雄黄作为传统中药，在耐药性、选择性抑制肿瘤细胞等方面表现较好，且对正常细胞的毒性作用较轻微。近年来，随着医疗技术的飞速发展，各种纳米雄黄不断涌现[11]，在医药领域具有较大应用潜力。近年来国内外对雄黄抗肿瘤研究颇多。本文重点综述雄黄诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤干细胞分化和血管生成以及协同其他药物抗肿瘤的作用及分子机制，以期为雄黄安全合理临床应用提供参考。

1 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是一种清除损伤细胞的程序性细胞死亡形式，由3个阶段组成[12]：起始、转运和执行。此过程在应激刺激下诱导，癌前病变中的DNA损伤引起的细胞凋亡可去除潜在的有害细胞，从而阻止肿瘤生长。细胞凋亡的机制是复杂的，涉及许多触发途径，包括由Caspase介导的途径、凋亡调控因子的表达途径及内质网应激等途径。

1.1 影响Caspase依赖性凋亡通路

Caspase-3、Caspase-9是Caspase家族的重要成员，是细胞凋亡的关键效应分子、凋亡的执行者，当细胞接受凋亡信息时，两者可被激活。活化的Caspase-3和Caspase-9通过激活、破坏某些酶或细胞骨架蛋白等方式，导致特征性DNA断裂，从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。Cheng等[13]利用As4S4处理Siha宫颈癌细胞系，发现其对Siha细胞系细胞凋亡的诱导呈剂量依赖性，且与细胞色素C（Cyt C）释放增加和Caspase-3、Caspase-9激活相关。此外，As4S4诱导的细胞凋亡受广谱Caspase抑制剂的抑制。Ding等[14]基于As4S4处理4种人实体瘤细胞系，包括MKN45胃癌细胞系、A375恶性黑色素瘤细胞系、8898胰腺癌细胞系及HepG2肝癌细胞系，结果表明，As4S4可显著抑制实体瘤细胞的增殖，并通过激活Caspase-3和Caspase-9活性诱导细胞凋亡。Gong等[15]发现As4S4可显著抑制K562人慢性髓系白血病（CML）细胞系的增殖。miRNA为内源性非编码的小分子RNA，直接结合靶基因，对其mRNA进行剪切修饰或抑制翻译过程调控基因的表达[16]，As4S4通过下调miRNA表达，增加Caspase-3的活性及下调Bcl-2的mRNA和蛋白表达，以诱导K562细胞凋亡，从而靶向治疗CML。

1.2 调节凋亡调控因子表达

细胞凋亡可通过调节凋亡调控因子的表达，如通过凋亡因子诱发Bcl-2家族活化，诱导组蛋白γ-H2AX磷酸化[17]，调节膜转运Prohibitin蛋白[18]和凋亡抑制因子Survivin[19]等实现，抗凋亡和促凋亡蛋白之间的平衡调节是决定细胞是否经历凋亡的关键点。

1.2.1 诱发Bcl-2家族活化

目前认为，线粒体凋亡通路是通过凋亡因子诱发Bcl-2家族的活化[20]，致线粒体膜损伤、膜电位下降而释放Cyt C，Cyt C与凋亡酶激活因子结合可活化Caspase-9并最终激活效应因子Caspase-3，触发凋亡。王嫄等[21]使用As4S4（25 μmol/L）处理NB4-R1人急性早幼粒细胞细胞系，可使Bcl-2表达下调、Bax表达上调，以及将Caspase-3活性切割成活性片段，表明As4S4可有效诱导NB4-R1细胞凋亡。石利利等[22]使用As4S4干预SU-DHL-4弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）细胞系，发现所有给药组均出现典型的凋亡小体，80 μmol/L组可见部分坏死细胞。同时Bcl-2蛋白表达下调，Bax和Caspase-3蛋白表达上调，提示其可显著诱导SU-DHL-4细胞凋亡。An等[23]通过共沉淀法制备直径约80 nm的纳米雄黄，用其干预大鼠胶质瘤（C6）细胞，表明纳米雄黄可通过诱导Bax表达上调和Bcl-2表达下调促进细胞凋亡。杨玥等[24]研究表明，纳米雄黄可通过Caspase依赖途径诱导A549肺癌细胞凋亡，促进P53和Bax表达。

1.2.2 促进γ-H2AX蛋白磷酸化

当DNA损伤导致双链断裂时[17]，组蛋白H2AX也会随之磷酸化。H2AX是H2A蛋白家族的变体，是核小体中组蛋白八聚体的组成部分，可被PI3K通路中的激酶磷酸化，γ-H2AX新型磷酸化蛋白是DNA修补蛋白的第一步，可作为DNA损伤的生物标志物。Karaolanis等[25]利用γ-H2AX检测将正常组织转化为癌前组织，并因此转化为恶性组织的生物标志物。低浓度的ATO和纳米雄黄可增加肿瘤细胞内谷胱甘肽含量，上调γ-H2AX表达，提示ATO和纳米雄黄可导致细胞DNA损伤，进而诱发细胞凋亡。

1.2.3 上调Prohibitin蛋白表达

人类真核生物抑制素Prohibitin-1和Prohibitin-2是一种膜蛋白[18]，参与多种细胞功能，包括能量代谢、增殖、凋亡过程，调节膜转运的细胞信号、控制转录激活和细胞周期、线粒体内在凋亡途径。He等[26]使用As4S4干预APL细胞，发现Prohibitin（PHB）在经As4S4处理的细胞中表达增加，PHB过表达可促进细胞凋亡，同时降低早幼粒细胞白血病-视黄酸受体-α（PML-RARα）融合蛋白的表达，表明PHB在促进APL细胞凋亡中具有显著抗肿瘤活性。此外，Tian等[27]发现，As4S4诱导的细胞凋亡伴随着视黄酸抗性NB4-R1细胞中SET基因的mRNA和蛋白表达降低。蛋白磷酸酶2（PP2A）是一种促凋亡因子，PML-RARα是一种抗凋亡因子，其结果提示As4S4诱导的NB4-R1细胞凋亡是通过下调SET蛋白表达，增加PP2A、降低PML-RARα表达，致细胞凋亡实现的。

1.2.4 下调Survivin因子表达

Survivin是一种新的IAP基因，在肿瘤中显著高表达，并且与其蛋白水平相关。因此，Survivin作为肿瘤治疗的靶标，是恶性肿瘤对因治疗的理想选择。王胜玫等[19]研究发现，A549细胞经纳米雄黄处理24 h后，Survivin表达显著下降，提示其可通过该靶点促进肿瘤细胞凋亡。

1.3 诱导内质网应激

内质网是一种复杂的动态细胞器[28]，其功能包括蛋白质折叠、Ca2+储存、脂质和碳水化合物代谢。氧化还原失衡、蛋白质糖基化改变可导致未折叠或错误折叠的蛋白质积聚在内质网腔内，该情况称为内质网应激（ERS），因此它与自噬、缺氧信号传导或活性氧反应密切相关。

1.3.1 上调内质网蛋白编码基因表达

Wang等[29]利用具有改善的水溶性和生物利用度的雄黄量子点（RQDs），将人子宫内膜癌JEC细胞暴露于不同浓度的RQDs中，其结果提示RQDs可诱导JEC细胞的抗增殖活性，引发JEC细胞的空泡化和ERS。GADD153为生长停滞/DNA损伤诱导基因153，也称C/EBP同源蛋白，RQDs引起的ERS可上调GADD153和葡萄糖调节蛋白-78（GRP78）的mRNA和蛋白质表达，进一步导致JEC细胞凋亡和坏死。Qin等[30]使用RQDs干预HepG2细胞，发现给药浓度为15 µg/mL时，20%的细胞发生凋亡，30 µg/mL时60%的细胞坏死，并出现Bcl-2表达降低、Bax表达升高，线粒体膜电位丧失，应激基因C/EBP-HP10和GRP78表达增加。提示ERS诱导细胞凋亡和坏死可有效致使RQDs抑制HepG2细胞增殖。

1.3.2 诱导活性氧积累

活性氧在肿瘤细胞的凋亡中扮演着重要角色[31]，可通过活化的氧化应激来增强细胞毒性，破坏细胞大分子和DNA，从而导致细胞凋亡。Wang等[32]基于As4S4和As3+组合对NB4和原代APL细胞凋亡和分化的影响，证实As4S4可诱导活性氧积累，并促进细胞凋亡。此外，Song等[33]使用微生物内在的生物转化技术，得到了As4S4转化溶液（RTS），发现其可通过抑制细胞抗氧化防御系统，导致大量活性氧积累，阻断G2/M进程、激活细胞周期阻滞和线粒体凋亡通路，从而诱导细胞凋亡。

2 诱导肿瘤细胞自噬

自噬是一种分解代谢过程，将蛋白质、细胞质成分和细胞器传递到溶酶体进行降解和再循环，有30多个自噬相关基因控制自噬[28]，肿瘤坏死因子受体相关因子2依赖性IRE1和c-JunN-末端激酶（JNK）的活化导致Bcl-2磷酸化，使自噬调节蛋白Beclin-1解离，PI3K复合物活化和自噬启动。Liu等[34]发现经RQDs处理后的JEC细胞，自噬调节蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、p62和Atg12表达发生显著变化，提示RQDs诱导JEC细胞自噬是其抗癌作用的机制之一，表明RQDs具有自噬诱导剂的应用潜能。Wang等[35]研究发现，纳米雄黄可通过下调活性氧和缺氧诱导因子（HIF）-1α的水平来诱导自噬，导致BCR-ABL抗凋亡基因降解、CML细胞系分化，从而抑制白血病细胞增殖，改善CML患者的造血功能。Pastorek等[36]通过比较纳米雄黄和ATO对人黑色素瘤细胞系BOWES和A375的作用，证实纳米雄黄和ATO对细胞死亡的诱导呈剂量依赖性，低剂量（0.3 µmol/L）时可增加溶酶体活性并诱导细胞自噬。

3 阻滞肿瘤细胞周期

细胞周期阻滞是As4S4抗肿瘤作用的重要机制，研究表明As4S4可通过阻滞细胞于有丝分裂期[22]，并调节细胞周期的关键调控蛋白实现[22，36]。石利利等[22]使用As4S4干预SU-DHL-4细胞株，结果表明20、40、80 μmol/L下均能抑制SU-DHL-4的增殖。经As4S4处理细胞48 h后，Bcl-2表达下调、Bax和Caspase-3表达上调，细胞周期受阻于S期。An等[23]研究表明纳米雄黄可显著增加S期和G2/M期细胞比例，降低G0/G1期细胞比例，从而抑制C6细胞增殖。Wang等[32]研究表明As4S4可阻止NB4和原代APL细胞G1/S转换。Liu等[34]发现RQDs可在JEC细胞中诱导G2期和S期阻滞。Pastorek等[36]研究显示，BOWES和A375细胞经纳米雄黄处理后，可诱导细胞周期G2/M期阻滞，以及改变IκB、Akt、ERK1/2、p38和JNK激酶的磷酸化，降低线粒体膜电位，从而抑制肿瘤细胞增殖。李立杰等[37]使用不同浓度（5、10、20、40 mg/L）纳米雄黄干预3种不同的宫颈癌细胞系（Caski/HPV16+，腺癌；Hela/HPV18+，鳞状细胞癌；C33A/HPV-，腺癌），发现其均可抑制不同宫颈癌细胞系的增殖，并诱导细胞凋亡，且高浓度纳米雄黄（20、40 mg/L）可诱导HPV阳性宫颈癌细胞的G2/M期阻滞。Wang等[38]通过构建真核SET表达质粒（pEGFP‑N1‑SET）并瞬时转染到293T人胚肾细胞，发现SET过表达增加了S期和G2/M期293T细胞百分比，转染的细胞中Bcl-2表达上调，Bax表达下调，且对As4S4诱导的凋亡的易感性降低。此外，使用As4S4（25 μmol/L）处理0、24、48 h的NB4-R1细胞，可增加S期细胞，减少G0/G1期细胞。

4 抑制肿瘤细胞增殖

抑制肿瘤细胞增殖可通过调节Wnt/β-catenin信号通路、NFATc3/c-Myc通路、STAT3信号通路实现。Hu等[39]用As4S4处理胃癌细胞，结果表明其可显著抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，同时促进细胞凋亡。胃癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活性受到过表达circRNA_ASAP2靶点和As4S4的影响，Wnt激动剂SKL2001可逆转由低表达circRNA_ASAP2引起的胃癌细胞行为变化，从而证实As4S4可通过调节circRNA_ASAP2/Wnt/β-catenin通路在胃癌细胞中发挥抗肿瘤作用，进而影响胃癌细胞的增殖和转移。齐元富等[40]研究发现，纳米雄黄对A549人肺癌细胞系的β-catenin和c-Myc表达均有明显抑制作用。初步揭示纳米雄黄可阻断Wnt信号转导通路，降低其关键因子β-catenin及下游c-Myc基因的表达，从而有效抑制A549细胞增殖。Zhang等[41]通过探讨NFAT在胃癌中的作用，发现As4S4可抑制NFATc1、NFATc3和NFATc4表达，调节p53和NFATc2表达，并在不同的胃癌细胞系（AGS、MGC803、MKN28、MKN45和SGC7901）中表现不同。此外，NFATc3的表达水平与As4S4的敏感性有关，可调节c-Myc表达，提示As4S4可通过NFATc3/c-Myc通路抑制胃癌细胞的增殖。Wu等[42]发现As4S4可通过抑制细胞因子信号通路抑制因子1甲基化和下游JAK2/STAT3信号通路，对U266人多发性骨髓瘤细胞表现出良好的抑制作用。Wang等[43]通过使用氧化亚铁硫杆菌的微生物浸出工艺，得到As4S4浸出液，用于干预CML细胞系K562和MDR-CML细胞系，发现其可下调K562/ADM细胞中多药耐药基因MDR1的mRNA和P-糖蛋白（P-gp）过表达，同时调节As4S4浸出液转运蛋白水通道蛋白9的表达，从而产生抑制细胞增殖的作用，进而引发细胞凋亡。

5 调控肿瘤细胞分化

细胞分化在肿瘤生长过程中的作用机制可分为促进肿瘤细胞分化[32]和抑制肿瘤干细胞分化[44]2个层面，肿瘤细胞分化有利于降低患者体内的肿瘤细胞数量，而肿瘤干细胞/癌症干细胞（TSC/CSC）是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，因此抑制TSC分化可减少肿瘤细胞的生成。

5.1 促进肿瘤细胞分化

随着临床应用及实验室研究的不断深入，发现雄黄干预肿瘤细胞存在剂量依赖的双重效应[32]，即高浓度可诱导细胞凋亡，低剂量长时间作用则可促进肿瘤细胞的不完全分化。Wang等[32]研究As4S4和As3+组合对NB4和原代APL细胞的影响，低浓度时（0.1～0.4 μmol/L）可诱导2种细胞分化，与As4S4或As3+处理组相比，联合用药明显促进2种细胞的凋亡和分化。Wang等[45]将纳米雄黄应用于ML细胞系K562、K562/AO2和CML患者骨髓原代细胞中，发现其可通过诱导CD11b、CD235a、Ter119和CD41a水平上调，降低骨髓中白血病细胞的百分比，从而诱导肿瘤细胞多向分化和凋亡。

5.2 抑制肿瘤干细胞分化

近年来，癌症生物学研究发现，代谢性葡萄糖重编程是癌症治疗的潜在靶点，而通过药物干预TSC的葡萄糖代谢及其相关的潜在机制仍然有待发掘[44]。Yang等[46]使用纳米雄黄干预肺癌干细胞（LCSCs），发现其可抑制细胞活力并诱导葡萄糖代谢，抑制代谢重编程相关蛋白表达，在体外和体内均可下调HIF-1α和PI3K/Akt/mTOR通路的表达，并通过抑制肿瘤生长改变肿瘤的组织学结构，从而抑制HIF-1α的表达。李慧杰等[47]研究发现，纳米雄黄可抑制代谢重编程关键因子HIF-1α表达，下调c-Myc基因、上调p53基因表达，同时抑制PI3K/Akt/mTOR通路，GLUT1、PDK1、PFK、PKM、PDH、LDH等相关蛋白及相关酶的表达，从而降低LCSCs的葡萄糖消耗。LCSCs以CD133+为主，约4%的CD133+细胞可表达P-gp及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）。结果显示，经不同浓度的纳米雄黄作用后，CD133+细胞的相对比例增加，P-gp和BCRP的表达降低。

6 降低肿瘤细胞迁移与侵袭能力

在上皮间质转化的过程中，除黏附能力缺失[48]，肿瘤细胞还通过破坏细胞与细胞之间的连接及广泛的细胞骨架重组，获得侵袭及转移的能力。Zhang等[49]选择人胃癌细胞系AGS和MGC803作为研究对象，经As4S4处理后，E-cadherin和KLF4表达上调，而β-catenin、VEGF、CD34和Sp1表达下调，且体内外实验研究结果一致，表明As4S4通过阻断肿瘤细胞黏附，降低肿瘤细胞破坏基底膜的能力，从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。Xi等[50]通过纳米雄黄干预小鼠乳腺癌细胞，发现其可显著抑制乳腺癌4T1细胞的迁移和侵袭，下调MMP-2和MMP-9的表达。同时，在小鼠乳腺癌转移模型中，纳米雄黄可有效抑制肿瘤细胞向肺、肝组织转移。

7 抑制肿瘤血管生成

血管内皮生长因子（VEGF）在调节血管生成的过程中起到重要作用[33]，能抑制体内及体外新生血管形成。肿瘤血管生成系统中基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9[49]与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）[33]联合作用，可作为血管生成与肿瘤侵袭转移的标志。Zhang等[49]通过体内外实验发现，As4S4可明显抑制MMP-2和MMP-9活性，下调VEGF表达，从而抑制其血管生成。刘寨东等[51]研究发现，纳米雄黄能抑制A549细胞的MMP-9表达，且随浓度增加其抑制效果愈显著，与顺铂联用的效果最显著。此外，齐元富等[52]研究发现纳米雄黄可显著降低VEGF、HIF-1在A549细胞中的表达，从而减少血管生成。Song等[33]发现RTS对抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）增殖、迁移、侵袭和血管形成具有很强的活性，可通过抑制VEGF/b-FGF的表达，导致VEGFR-2和下游蛋白激酶（包括ERK、FAK和Src）磷酸化。斑马鱼和鸡绒毛尿囊膜模型实验表明，RTS显著阻断了血管生成；在昆明种小鼠中，2.5 mg/kg的RTS对H22同种异体移植瘤的抑制作用达到50%以上，表明其可有效抑制肿瘤血管生成。Lee等[53]研究发现As4S4与白花蛇舌草和丹参提取物混合物可通过降低VEGFR2、Src和STAT3的磷酸化抑制VEGF诱导的HUVEC增殖、迁移和肿瘤血管形成，并抑制绒毛尿囊膜的血管生成。此外，其可减弱A549和H460细胞中pro-PARP、Bcl-2、Cyclin E、Cyclin A、CDK2、E2F1、p-Src、p-STAT3、p-ERK、p-AKT、COX-2和SOCS-1的表达，并破坏STAT3与CDK2或VEGF的结合，提示As4S4可通过抑制STAT3/VEGF/CDK2发挥抗血管生成作用。

8 协同用药

现代医疗在抗肿瘤治疗上已取得一定成效，而传统中药与化学疗法联合可进一步增加治疗效果，并在药物毒性、耐药性方面有一定改善。Zhang等[54]使用胃癌和结肠癌细胞系研究As4S4与BRD4抑制剂JQ1或化疗药物顺铂和伊立替康或COX2抑制剂塞来昔布联合使用的抗肿瘤作用，结果表明联合用药可激活p53表达，同时抑制BRD4、c-Myc、COX2和cyclinD1表达，增强对COX2、BCL2和p38表达的抑制作用，激活Caspase-3等多种细胞凋亡途径，表达显著的细胞毒性。Tan等[55]研究发现，BRD4抑制剂JQ1与As4S4协同使用时，可降低活化T细胞（NFAT）的核因子-κB（NF-κB）表达、上调凋亡蛋白及下游癌基因c-Myc，并通过线粒体途径，即降低线粒体膜电位、减少Cyt C释放和激活Caspase-3活性来诱导细胞凋亡，从而有效增强BET抑制剂在胃癌和结肠癌等晚期实体瘤中的细胞毒性。Wang等[32]证实As4S4与As3+协同作用时，可下调Bcl-2和NF-κB的表达，上调Bax和p53的表达，并激活Caspase-12和Caspase-3。此外，低浓度As4S4和As3+的组合促进了PML-RARα癌蛋白的降解。Lee等[52]研究发现As4S4和PROS混合物具有显著的细胞毒性，可诱导亚G1期和S期阻滞，增加凋亡小体。刘寨东等[51]以不同浓度的纳米雄黄（25、100 μg/mL）与顺铂（2 μg/mL）单用或联用干预体外培养的A549细胞，提示纳米雄黄可抑制b-FGF表达，联合应用抑制强度随浓度的增加而增强。

9 展望

中医防治肿瘤具有坚实的历史基础，而现代科技为其发展创造了有利条件[56]。雄黄作为从古代沿用至今的中药，在现代临床研究中应用广泛，并在多种癌症类型中均表现出较强的抗癌作用。其抗肿瘤机制主要分为靶向作用于肿瘤细胞和间接抑制肿瘤细胞生长两方面，包括诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和抗肿瘤血管生成，抑制肿瘤干细胞分化等。采用现代制剂技术将其制成低毒、高效、生物利用度高且具有良好抗肿瘤功效的纳米颗粒，与其他抗癌药物协同用药时可显著增强抗肿瘤活性、提升药敏性、克服耐药性并减缓药物毒性。近年来关于雄黄As4S4其纳米雄黄、微生物转化液等抗肿瘤相关文献显示，其可通过多条信号通路发挥抗肿瘤活性。

雄黄治疗恶性肿瘤研究中取得了较大进展，但其安全性和疗效尚待进一步研究。建议今后研究更系统地阐明中药雄黄在不同人类肿瘤细胞中的作用机理及使用安全性，使其在临床更大程度地发挥抗癌活性，提高癌症患者生存质量。