基于网络药理学探究御丰膏对皮肤抗衰老的作用机制

李利，韩爱萍，田源，刘浩思，邹天畅，刘孝飞，李振华，徐春明*

（1.北京工商大学 人工智能学院，北京 100048；2.北京工商大学 轻工科学技术学院，北京 100048；3.北京玫瑰日记生物科技有限公司，北京 100024；4.北京有肌时代科技有限公司，北京 100024）

皮肤衰老是多种因素共同作用的结果，这些因素大致可划分为内部因素和外界环境因素。快节奏的生活、精神压力和内耗的增加，导致女性提前衰老的情况越来越多。尤其是女性进入更年期后，因雌激素水平下降，其皮肤老化逐渐明显。由内延缓皮肤衰老的本质是改变机体内分泌环境，其中雌激素对皮肤的改善作用最为显著[1]。皮肤衰老机制中，最为广泛接受的是自由基导致胶原蛋白异常氧化、变性等，致使皱纹增多、皮肤老化[2]。

葛根、人参和雪莲对于抗氧化、调节内分泌和体内雌激素水平都有一定的功效。葛根是我国传统的药食同源植物[3]，含有丰富的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗衰老等作用[4]。《神农本草经》中记载，人参具有补五脏、安精神、益智等功效[5]。雪莲的使用历史悠久，具有活血通络、治疗经血不调等功效[6]。但是，葛根-人参-雪莲抗皮肤衰老的作用机制尚不明确。本研究利用网络药理学的方法分析御丰膏中葛根-人参-雪莲抗皮肤衰老的作用机制，为进一步研究提供思路。

1 材料与方法

1.1 化合物成分及靶点分析

使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），检索葛根、人参、雪莲化合物成分，设置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18。检索UniProt 数据库，进行靶点标准化。在GeneCards 数据库中，检索“estrogen”“antioxidant”“internal secretion”，获得相关靶点。将结果进行整合，得到葛根-人参-雪莲潜在作用靶点。

1.2 韦恩图绘制及靶点蛋白互作（PPI）网络构建

利用R 语言绘制成分靶点和内分泌、雌激素、抗氧化的相关靶点的交集靶点韦恩图。使用STRING在线分析平台，设置置信度＞0.7，预测靶点与靶点之间的相互作用关系。再利用Cytoscape 3.9.1 软件进行拓扑分析，构建“中药-成分-靶点”PPI 网络。

1.3 富集分析

将整理好的靶点蛋白信息用DAVID 数据库进行富集分析。选择“Homo sapiens”，将数据导入Excel。用R 语言进行GO 及KEGG 通路富集分析，分析靶点蛋白与通路间关系，并构建“活性成分-靶点-通路”网络。

1.4 分子对接验证

对PPI 网络图中获得的核心靶点进行验证，利用AutoDock Tools 1.5.7 软件进行分子对接，通过结合能判断结合情况，利用PyMOL 进行可视化。靶蛋白pdb文件和活性成分分子结构分别来源于PDB 和TCMSP数据库。

2 结果与分析

2.1 活性成分筛选结果

通过TCMSP 数据库筛选，共获得kaempferol（山奈酚）、quercetin（槲皮素）等33 个有效活性成分，其中葛根4 个、人参22 个、天山雪莲7 个。

2.2 靶点分析及“中药-活性成分-靶点”网络图构建结果

通过GeneCards 数据库筛选（相关性＞10），并将重复成分和靶点剔除，最终得到21 个活性成分和156 个靶点。如图1 所示，利用Cytoscape 3.9.1 软件，根据值（Degree）和介数中心性（Betweenness）绘制网络互作关系。图中节点越大，越重要。A1 和B1 分别代表葛根-人参-雪莲的重复活性成分β-谷甾醇和人参-雪莲的重复活性成分山奈酚。

图1 中药-成分-靶点图

2.3 韦恩图绘制及PPI 网络的建立与分析

如图2 所示，分别获得葛根-人参-雪莲与抗氧化、雌激素和内分泌相关靶点5 个、20 个和75 个。如图3 所示，运用Cytoscape 3.9.1 绘制网络图并明确关键靶点。由于与抗氧化作用相关的靶点较少，且HMOX1 核心靶点情况较为明显，故不进行绘图展示。最终获得血管内皮生长因子（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）、细胞色素P450 1A1 蛋白（CYP1A1）、血红素加氧酶1（HMOX1）等关键靶点。

图2 韦恩图

图3 PPI 网络图

2.4 富集结果分析

利用DAVID 数据库进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析（P＜0.05），结果如图4（a）所示。发现葛根-人参-雪莲的核心靶点是通过影响腺体发育、多肽激素表达及信号释放等生物过程进行调控。经京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集，筛选出185 条信号通路（P＜0.05），选取占比前20的通路，利用R 语言进行可视化，见图4（b）。

2.5 活性成分-靶点-通路网络构建

构建葛根-人参-雪莲活性成分-靶点-通路图，如图5 所示。圆形代表通路，神经活性配体-受体相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）通路发挥着最重要的作用；箭头代表成分，发挥最主要作用的是木犀草素（XL5）；菱形代表靶点。

图5 葛根-人参-雪莲活性成分-靶点-通路图

2.6 分子对接

选择“中药-成分-靶点”网络中“Degree ＞20”的活性成分，与关键靶点VEGFA、EGFR、肿瘤蛋白p53 基因（TP53）、TNF、白介素6（IL6）、CYP1A1、雌激素受体（AR）、HMOX1 进行结合能预测。结果显示，木犀草素与VEGFA 和TNF 的结合能分别是-19.79 kJ/mol 和-26.65 kJ/mol；山奈酚与TNF的结合能为-25.44 kJ/mol；槲皮素与TNF 的结合能为-24.35 kJ/mol。说明葛根-人参-雪莲中的活性成分与关键靶点有较好的结合性，这也印证了之前的猜测。可视化结果见图6。

图6 分子对接模式图

3 讨论与结论

本研究筛选得到33 个葛根-人参-雪莲有效活性成分，相关交集靶点100 个。富集分析结果显示，葛根-人参-雪莲是通过影响腺体发育、多肽激素表达及信号释放等生物过程对雌激素、内分泌及抗氧化进行调控。并通过调节神经活性配体-受体相互作用、PI3K-Akt 信号通路等起到抗皮肤衰老的作用。有研究发现，槲皮素、木犀草素和山奈酚可直接作用于蛋白激酶B（Akt）[7]，而Akt 可以通过PI3K-Akt 信号通路增加卵巢内血供[8]，增加雌激素分泌，改善皮肤状态。木犀草素、槲皮素、山奈酚都属于黄酮类化合物，该类化合物具有抗氧化、抗炎及缓解更年期综合征等作用[9]，是一类很好的能够双向调节机体雌激素水平的化合物[10]。雌激素的稳态对于女性的生理健康及生长发育具有十分重要的作用，对于低雌激素水平的女性人群适当提高雌激素水平，可以调节女性的第二性征的发育，如可以通过刺激胸部的相关受体，达到促进胸部发育的效果。此外，适当补充抗氧化物质能够增加肌肤弹性，延缓皱纹的产生。

葛根、人参和雪莲是常见的药食同源中药。本研究将三者结合，利用网络药理学和分子对接技术，探讨了御丰膏中葛根-人参-雪莲抗皮肤衰老的作用机制。为进一步通过药食同源方法，改善皮肤状态，延缓皮肤衰老提供参考。