正交法优化废弃卤虫冻干保护剂

李陇梅，闫东科，吕平，李雪，王永苓，郭媛

（1.天津职业大学，天津 300410；2.杰科(天津)生物医药有限公司，天津 300467；3.天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350）

卤虫是一种广泛分布于日晒盐场盐池、沿海滩涂和内陆盐湖的小型甲壳类嗜盐滤食动物。卤虫无节幼体因营养成分含量高且全面、鱼虾蟹幼苗适口性好、游泳速度慢极易被捕获等优点，成为各类水产苗种最佳的活体开口饵料。由于养殖水体中的各期卤虫幼体及其成体体长较大不适宜作为水产苗种的开口饵料[1]，而且质量不稳定、运输贮存和加工费用较高，所以各地养殖单位只捕捞卤虫滞育卵进行生产销售。而大量的卤虫虫体废弃在水中，造成了成千上万吨的卤虫虫体资源浪费，增养殖水体也遭到了极大污染。卤虫富含淡水鱼所需的α-亚麻酸（ALA）、海水鱼所需的二十碳五烯酸（EPA），且卤虫体内二十二碳六烯酸（DHA）含量也非常高。就营养价值而言，中后期卤虫幼体及其成虫的营养价值要高于滞育卵孵化出的用于饲养水产苗种的Ⅰ期无节幼体[2]。因此，开发利用废弃卤虫虫体资源已迫在眉睫，创新技术手段以解决卤虫虫体资源浪费的产业困境已刻不容缓。

目前，多用真空冷冻干燥制备卤虫冻干粉，但其中冷冻和干燥两个过程均会造成营养成分不同程度的损失，如果对废弃卤虫直接进行冷冻干燥，营养物质只能保留冷冻干燥前的10%～30%，若将虫体悬浮于适宜的介质中再进行冷冻干燥，营养物质的保存率可超过70%。因此，选择合适的冻干保护剂非常必要[3]。海藻糖和蔗糖，可通过抑制蛋白质的展开和提供玻璃基质起保护作用[4]；甘露醇被认为是良好的冻干填充剂，应用最广泛；精氨酸可以与蛋白质形成大约7 个氢键，因此精氨酸是过去最常用的氨基酸类冷冻干燥保护剂[5]。

本研究通过单因素实验研究了海藻糖、甘露醇、蔗糖和精氨酸等4种物质对卤虫冻干营养物质保存率的影响；在此基础上，采用正交实验对卤虫的冻干保护剂组分进行了优化，从而为卤虫冻干粉的生产提供了一定的参考依据[6]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

废弃卤虫，杰科（天津）生物医药有限公司；KH19A 小型高速离心机，德国Eppendorf 公司；FD-1D-50 真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；GC-2030 型气相色谱仪，配备氢火焰离子化检测器（FID），日本岛津公司；970CRT 荧光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；海藻糖，食品级，西安木果生物科技有限公司；甘露醇，食品级，江苏华港生物科技有限公司；蔗糖和精氨酸，食品级，伊诺杰康江苏肽都科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的处理

将保护剂按比例分别加入到待冻干废弃卤虫溶液中，待保护剂完全溶解后，放置至无菌托盘内备用，每盘100 mL。

1.2.2 冻干处理

将分装好的样品放入冷冻干燥机的预冻室，使冻干机的冷阱温度降至-50 ℃以下。将预冻好的样品迅速放入冻干机的搁板上并盖上真空罩，开启真空泵抽真空，使真空度降至1 Pa，并保持12 h；待样品完全干燥后，4 ℃保存备用。

1.2.3 单因素实验

（1）海藻糖质量分数。分别设计海藻糖质量分数为5%、10%、20%、25%，蔗糖、甘露醇、精氨酸质量分数分别为5%、4%、1%，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与卤虫等重。（2）蔗糖质量分数。分别设计蔗糖质量分数为5%、10%、20%、25%，海藻糖、甘露醇、精氨酸质量分数分别为5%、4%、1%，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与卤虫等重。（3）甘露醇质量分数。分别设计甘露醇质量分数为4%、8%、12%、16%，海藻糖、蔗糖、精氨酸质量分数分别为5%、5%、1%，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与卤虫等重。（4）精氨酸质量分数。分别设计精氨酸质量分数为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，海藻糖、蔗糖、甘露醇质量分数分别为5%、5%、4%，并补充磷酸缓冲液使添加物总量与卤虫等重。

1.3 测定方法

ω-3 多不饱和脂肪酸的测定依据《DHA、EPA含量测定 气相色谱法》（GB/T 38095—2019）；维生素C（Vc）含量的测定依据《饲料添加剂 维生素C（L-抗坏血酸）》（GB/T 7303—2018）。

2 结果与分析

2.1 海藻糖单因素分析

冻干样品DHA、EPA 和VC含量如图1所示。从图1中可以看出，随着海藻糖质量分数的增加，冻干卤虫中的DHA、EPA 和VC 含量呈现先升高后降低的趋势，当海藻糖质量分数达到20%时，各指标含量达到峰值：DHA 含量为2.7 g/kg，EPA 含量为1.2 g/kg，VC含量为28.5 mg/kg。

图1 海藻糖质量分数对卤虫冻干的影响

2.2 蔗糖单因素分析

冻干样品DHA、EPA 和VC含量如图2 所示。从图2 中可以看出，随着蔗糖质量分数的增加，冻干卤虫中的DHA、EPA 和VC含量变化趋势不一致，当蔗糖质量分数达到10%时，Vc 和EPA 含量达到最大值，分别为28.1 mg/kg 和1.4 g/kg；当蔗糖质量分数达到20%时，DHA 含量达到最大值，为2.8 g/kg。

图2 蔗糖质量分数对卤虫冻干的影响

2.3 甘露醇单因素分析

冻干样品DHA、EPA 和VC含量如图3 所示。从图3 中可以看出，随着甘露醇质量分数的增加，冻干卤虫中的DHA、EPA 和VC含量变化趋势基本为先升高后降低，当甘露醇质量分数达到8%时，DHA 含量达到最大值为3.3 g/kg；当甘露醇质量分数达到12%时，VC和EPA 含量达到最大值，分别为24.7 mg/kg和1.2 g/kg。

2.4 精氨酸单因素分析

冻干样品DHA、EPA 和VC含量如图4 所示。从图4 中可以看出，随着精氨酸质量分数的增加，冻干卤虫中杆菌的DHA、EPA 和VC 含量变化趋势为先升高后降低，当精氨酸质量分数达到1.5%时，EPA 含量达到最大值，为1.3 g/kg；当精氨酸质量分数达到2.0%时，DHA 和VC含量达到最大值，分别为3.3 g/kg 和5.4 mg/kg。

图4 精氨酸质量分数对卤虫冻干的影响

2.5 正交实验

在单因素的基础上，采用4 因素3 水平试验设计，对海藻糖质量分数（A）、蔗糖质量分数（B）、甘露醇质量分数（C）、精氨酸质量分数（D）4个因素进行考察，分析筛选出影响较大的因素及最佳冻干保护剂配方，各种保护剂水平设计及结果见表1，其中响应值Y为DHA 含量，Y′为EPA 含量，Y′′为维生素C含量。

表1 正交实验设计及结果

由表1极差R、R′、R′′分析可知，4 种保护剂对冻干的DHA、EPA、维生素C 含量的影响作用是一致的，其中海藻糖质量分数对营养质量分数对营养成分的影响最大。根据极差分析，含量最高组的最佳组合为A2B2C1D3，因为这个组合不在已做的9次试验中，所以对A2B2C1D3进行了单独验证，发现冻干卤虫的三种营养成分的保存率为90%以上，均高于表1中的含量，所以最佳组合为A2B2C1D3，即最佳冻干保护剂配方为20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入该保护剂后，卤虫中DHA、EPA、VC 的含量分别为4.8 g/kg、2.2 g/kg、38.3 mg/kg。

3 结论

废弃卤虫的最佳保护剂配方为20%海藻糖+15%蔗糖+8%甘露醇+2%精氨酸。加入冻干保护剂后，检测二十二碳六烯酸（DHA）为4.8 g/kg，二十碳五烯酸（EPA）为2.2 g/kg，维生素C 含量为38.3 mg/kg。