UPLC-Q-TOF-MS／MS 法分析鼻渊通窍颗粒化学成分

李晓晨，王 帅，李天娇，赵 琳*，包永睿*，孟宪生，王义明，罗国安，张贵民，关永霞，程国良，李 冰

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.清华大学，北京 100084；3.中药制药共性技术国家重点实验室，山东 临沂 276000）

鼻渊通窍颗粒由辛夷、苍耳子（炒）、麻黄、连翘、黄芩等14 味中药组成，是在《济生方》 所载“苍耳散”的基础上加味而成，配伍严谨，组方合理，具有扶正祛邪、益气固表的功效［1］。现代临床用于用鼻渊（急性鼻窦炎）、反复感冒、鼻塞、流涕。多种中药配伍应用，实现了多层面、多途径、多靶点的调节治疗作用。目前，关于鼻渊通窍颗粒的报道仅限于常规的定性定量研究，对其物质基础的研究鲜有报道［2-11］。而中药的药效物质不清晰、不明确恰是阻碍中药发展的关键问题。本实验拟对鼻渊通窍颗粒药效物质基础进行研究，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS／MS） 法对鼻渊通窍颗粒中的化学成分进行表征，并在明确鼻渊通窍颗粒的化学成分的同时，进一步对鉴定成分进行结构层级分类，根据结构-活性关系为鼻渊通窍颗粒药效活性、质控指标的筛选评价提供参考，以期为其今后药效物质基础及临床合理应用等研究奠定扎实的前期基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 鼻渊通窍颗粒（批号0022003008，山东新时代药业有限公司）；绿原酸、连翘苷、阿魏酸、槲皮素、1，3-二咖啡奎宁酸对照品（批号753-8701、821-9401、0773-9910、100081-200406、111717-200501，纯度＞98%，中国食品药品检定研究院）；橙皮苷、咖啡酸、欧前胡素、佛手柑内酯、木犀草素、芹糖基甘草苷对照品 （批号160590、17122804、160511、150126、17120702、140614，成都普菲德生物技术有限公司）；黄芩素、甘草苷、白杨素、木犀草苷、蒙花苷对照品（批号18021403、16071504、18042601、16071504、16080201，四川省维克奇生物科技有限公司）。甲醇（色谱纯，德国Merck 公司）；甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2 仪器 Agilent 1290 型快速高效液相色谱仪、Agilent 6550 Q-TOF-MS 质谱 （美国 Agilent 公司）；Sartorius CP225D 电子分析天平（德国Sartorius 公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备2.1.1 对照品溶液 精密称取绿原酸、咖啡酸、1，3-二咖啡酰奎宁酸、芹糖甘草苷、甘草苷、阿魏酸、橙皮苷、连翘苷、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、蒙花苷、佛手柑内酯、白杨素、黄芩素、欧前胡素对照品适量，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。

2.1.2 供试品溶液 取鼻渊通窍颗粒细粉2.0 g，精密称定，至具塞锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，精密称定质量，超声处理40 min，放冷后用甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS／MS 分析条件

2.2.1 色谱 Agilent poroshell120 SB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流动相0.1%甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～30 min，5%～100%B）；体积流量0.4 mL／min；柱温30 ℃；进样量0.5 μL。

2.2.2 质谱 电喷雾离子源（ESI）；正、负离子模式；毛细管电压4 000 V （ESI+）、-3 500 V （ESI-）；干燥气体温度250 ℃；鞘气温度350 ℃；干燥气体体积流量13 L／min；鞘气体积流量11 L／min；雾化器压力45 psi （1 psi＝6.895 kPa）；碎裂电压125 V；质量范围m／z100～1 000。

2.3 数据分析 结合中药系统药理学数据库与分析平台，PubChem 数据库中质谱信息以及相关文献，建立全方化学成分信息库，要色谱峰的精确相对分子质量与自建的化学成分信息库进行比对，推测各化合物的分子式，结合对照品质谱碎片信息对色谱峰进行指认以及化学结构层级分类。

2.4 化学成分分析 取“2.1” 项下对照品溶液、供试品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定，依据对照品保留时间和文献报道分析数据，对各色谱峰进行成分鉴定，再进一步将鼻渊通窍颗粒全方图谱中已知化合物的保留时间与各单味药图谱的色谱峰进行比对，将各化合物结构进行层级分类。

3 结果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS／MS 成分鉴定 取“2.1” 项下对照品溶液、供试品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定，得正、负离子模式下的基峰离子图，见图1。

图1 鼻渊通窍颗粒正、负离子模式下基峰离子图

按“2.3” 项下MS 数据分析方法确定化学成分的结构，对鼻渊通窍颗粒主要成分进行快速表征出105 个色谱峰，结果共推断出104 种化学成分，包括29 种黄酮类、19种萜类、12 种木脂素类、11 种香豆素类、9 种醌类、24 种其他类，结果见表1。

表1 鼻渊通窍颗粒中的化学成分

3.2 主要化合物多层级研究

3.2.1 黄酮类

3.2.1.1 层级分类 黄酮类化合物广泛存在于自然界，是一类基本母核为2-苯基色原酮的化合物，大部分以游离形式、与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在，黄酮类化合物在质谱条件下的断裂方式主要有CO、CO2、C2H2O、H2O等中性粒子的丢失和RDA 裂解以及糖基的断裂。从鼻渊通窍颗粒中共鉴定出29 个黄酮类化合物。化学结构层级分类见图2 （其中红色部分为该类化合物母核结构，紫色为一级结构，蓝色为二级结构）。

图2 黄酮类化合物层级结构分类

3.2.1.2 裂解规律 以槲皮素为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z303.050 0 ［M+H］+，其产生的特征二级离子碎片m／z285.039 1 ［M+H-H2O］+、257.043 3 ［M+HH2O-CO］+、247.060 4 ［M+H-2CO］+，均为槲皮素的特征碎片，结合数据库及文献报道，与对照品对比，推测54 号峰为槲皮素，其可能的裂解规律见图3。

图3 槲皮素裂解规律

3.2.2 萜类

3.2.2.1 层级分类 萜类化合物具有（C5H8）n通式及其衍生物，自然界广泛存在的一类植物次生代谢产物，是植物次生代谢产物中种类最多的化合物，迄今已发现近40 000种，以异戊二烯为基本结构单位。从鼻渊通窍颗粒中共鉴定出19 个萜类化合物。

3.2.2.2 裂解规律 以茯苓新酸A 为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z521.323 7 ［M+Na］+，推测其分子式为C31H46O5，在二级质谱中可见碎片离子m／z507.308 1 ［M+Na-CO2］+、489.297 5 ［M+Na-CO2-H2O］+、433.271 3 ［M+Na-CO2-C3H6O2］+特征碎片，推测100 号峰为茯苓新酸A，其可能的裂解规律见图4。

图4 茯苓新酸A 裂解规律

3.2.3 木脂素类

3.2.3.1 层级分类 木脂素是一类由两分子苯丙素衍生物（即C6-C3单体） 聚合而成的天然化合物，多数呈游离状态，少数与糖结合成苷。组成木脂素的单体有桂皮酸、桂皮醇、丙烯苯、烯丙苯等。它们可脱氢，形成不同的游离基，各游离基相互缩合，即形成各种不同类型的木脂素，结合位置多在β 位。从鼻渊通窍颗粒中共鉴定出12 个木脂素类化合物。

3.2.3.2 裂解规律 以连翘苷为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z557.199 8 ［M+Na］+，推测其分子式为C27H34O11，在二级质谱中可见碎片离子m／z395.136 6 ［M+Na-C6H10O］+、379.199 8 ［M+Na-C6H10O6］+、309.134 5［M+Na-C14H16O4］+特征碎片，通过与对照品质谱图比对，推测50 号峰为连翘苷，其可能的裂解规律见图5。

图5 连翘苷裂解规律

3.2.4 香豆素类

3.2.4.1 层级分类 从鼻渊通窍颗粒中鉴定出11 个香豆素类化合物，该类成分经高能碰撞后易发生CH3、CO 等中性丢失。

3.2.4.2 裂解规律 以佛手柑内酯为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z239.031 7 ［M+Na］+，推测其分子式为C12H8O4，在二级质谱中可见碎片离子m／z224.007 7 ［M+Na-CH3］+、196.012 1 ［M+Na-CH3-CO］+、168.018 8 ［M+Na-CH3-CO-CO］+特征碎片，通过对照品质谱图比对，推测63 号峰为佛手柑内酯，其可能的裂解规律见图6。

图6 佛手柑内酯裂解规律

3.2.5 醌类

3.2.5.1 层级分类 醌类化合物是中药中一类具有醌式结构的化学成分，主要分为苯醌、萘醌、菲醌、蒽醌。从鼻渊通窍颗粒中共鉴定出9 个醌类化合物。

3.2.5.2 裂解规律 以丹参酮ⅡA为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z317.114 7 ［M+Na］+，推测其分子式为C19H18O3，在二级质谱中可见碎片离子m／z299.122 7 ［M+Na-CH3］+、302.104 9 ［M+Na-H2O］+特征碎片，通过对照品质谱图比对，推测97 号峰为丹参酮ⅡA。

3.2.6 其他

3.2.6.1 分类 从鼻渊通窍颗粒中鉴定出8 个芳香族类、7 个有机酸类、4 个酯类、3 个生物碱类、2 个脂肪酸类、1个未知化合物。

3.2.6.2 裂解规律 以绿原酸为例，正离子模式下可见准分子离子峰为m／z377.083 7 ［M+Na］+，推测其分子式为C16H18O9，在二级质谱中可见绿原酸特征碎片m／z499.119、203.035 5、193.049 2、163.038 1，通过对照品质谱图比对，推测22 号峰为绿原酸。

4 讨论

本研究以鼻渊通窍颗粒为研究对象，采用HPLC-QTOF-MS／MS 技术对其化学成分进行表征，进一步对表征出的化学成分进行层级分类。包括29 个黄酮类成分，推断其来源于苍耳子、麻黄、黄芩、天花粉、甘草［12］，所占数量比重最大，与文献报道相符；19 种萜类成分，推断其来源于野菊花、茯苓、甘草；12 种木脂素类成分，主要来源于连翘、地黄［13-14］；9 种醌类成分，主要来源于丹参［15］；11种香豆素类成分，主要来源于白芷［16］；25 种其他类成分，主要来源于辛夷、薄荷、藁本。

化学结构层级分类是描述经典的结构-活性关系。现代药理学研究表明，各种成分发挥的药理药效作用由其母核结构决定，在此基础上，不同结合位点所连接的取代基、官能团不同划分出其二级结构；药物在体内与特定的受体部位发生相互作用，引发生物活性，不同结构的化合物影响药物在体内的吸收、分布和代谢。黄酮类化合物基本母核为2-苯基色原酮，黄酮类化合物结构中常连接有酚羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团，基于其不同的结合位点又将其分为二氢黄酮类、异黄酮类、二氢异黄酮类等。已有研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、止咳、祛痰、平喘及抗菌，抗自由基，抗氧化，抑菌，延缓正常组织细胞凋亡，调节动物激素，提高机体免疫机能等多种药理作用［17］；萜类物质具有抗炎、免疫调节、抗过氧化、抗感冒、抗流感等药理作用；木脂素类抗病毒、抗菌、保肝作用；醌类成分具有抗菌抗病毒的功效，其中抑菌作用的效果最为显著；香豆素类成分具有抗炎、解热、镇痛、抗病原微生物的作用，用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻渊等［18-19］。

化合物骨架结构决定其性质，明确各类成分结构及其一、二级结构，依据结构-活性关系可为今后鼻渊通窍颗粒中各类化学成分的分离结构鉴定，单体化合物的药效活性筛选和评价以及药效物质基础及临床合理应用等研究奠定基础。