UPLC-Q-TOF-MS／MS 法结合网络药理学研究滇重楼抗肺癌活性成分

杨远贵，李 凡，许洪波，周新朋，卫培峰，唐志书，5*

[1.陕西中医药大学，陕西省中药资源产业化协同创新中心，秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西 咸阳 712046；2.陕西国际商贸学院，陕西 咸阳 712046；3.山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014；4.陕西中医药大学第二附属医院，陕西 咸阳 712000；5.中国中医科学院，北京 100700]

肺癌是癌症相关疾病死亡的主要原因，统计发现肺癌占癌症死亡的19.4%［1］。目前，化疗是治疗肺癌病人的主要手段［2］，为提高肺癌患者的生活质量和生存期，亟待开发新的肺癌治疗药物。重楼具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊的功效［3］，可用于治疗鼻咽癌、肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、子宫肌瘤、白血病等［4］。研究发现，重楼皂苷Ⅰ、Ⅶ可有效抑制NSCLC 细胞系A549 的增殖、转移［5］，诱导细胞凋亡［6］。

网络药理学与传统药理学不同，从系统和整体角度研究药物、靶点、疾病，更能符合中药的整体观，其用于中药的研究具有独特的优势［7-8］。Wang 等［9］采用LC-MS 法和网络药理学研究毛茛抗类风湿性关节炎的药效物质基础及其分子机制，共发现9 种活性成分是毛茛化合物-靶点-通路中的关键节点，采用类风湿关节炎滑膜成纤维细胞进行验证，结果表明小檗碱和甲氧醉椒素具有抗类风湿关节炎的作用。

针对重楼抗肺癌药效物质及作用机制存在的问题，本研究以重楼为研究对象，采用UPLC-Q-TOF-MS／MS 法对重楼中化学成分进行整体表征，结合网络药理学辨识重楼抗肺癌的活性成分，分析重楼抗肺癌活性关键靶点和作用机制，探讨其药效物质基础，为质量控制的提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Shimadzu LC-30A 高效液相色谱仪，串联飞行时间质谱仪，配有LC-30A 二元液相泵、SIL-30AC 自动进样器、CTO-20AC 柱温箱（日本Shimazdzu 公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius BSA 124S-CW 电子分析天平［万分之一，赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］；Eppendorf 5424R 离心机 （德国Eppendorf 公司）；S0200-230V 涡旋混合仪（深圳市赛泰克生物科技有限公司）；Milli-Q 超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试剂与药物 重楼为云南省丽江市5 年生滇重楼，由云南省农业科学院药用植物所王元忠副研究员鉴定为正品。重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；重楼皂苷Ⅴ、重楼皂苷Ⅲ购自成都曼思特生物科技有限公司。甲酸、乙腈、甲醇为色谱纯，购自美国赛默飞世尔公司；甲醇为分析纯，购自国药集团上海有限公司。

2 方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS／MS 条件

2.1.1 色谱 ACQUITY UPLCTM HSS T3 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～5 min，19% B；5～15 min，19%～28% B；15～25 min，28%～40% B；25～35.5 min，40%～95% B；35.5～40 min，95%B；40～42 min，19%B）；体积流量0.3 mL／min；进样量2 μL。

2.1.2 质谱 电喷雾（ESI） 离子源；负离子模式；气帘气35 psi （1 psi＝6.895 kPa）；离子化电压4 500 V；加热模块温度500 ℃；喷雾气55 psi；辅助加热气50 psi；碰撞电压20～60 V；质谱扫描范围m／z100～1 500。

2.2 对照品溶液制备 精密称取重楼皂苷Ⅰ（5.01 mg）、重楼皂苷Ⅱ（5.42 mg）、重楼皂苷Ⅲ（5.23 mg）、重楼皂苷Ⅴ（5.64 mg）、重楼皂苷Ⅵ（5.26 mg）、重楼皂苷Ⅶ（5.48 mg），溶于5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备 称取滇重楼粉末（过4 号筛）1.003 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，称定质量，超声处理（功率250 W、频率100 kHz） 50 min，静置，补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得。

2.4 化合物结构解析 整理重楼化学成分数据库，将包含化合物名称、分子量、分子式、代表性碎片、化合物药用部位表格导入到LibraryView 中建立重楼化学成分数据库。打开MasterView，将样品数据导入，与已建立的数据库进行质谱数据匹配，并进行结果分析，将匹配程度较高（结果列表中显示绿色高亮的化合物） 导出。结合数据库匹配、对照品比对、样品质谱裂解碎片、文献数据比对、化合物结构组成等相关信息，对滇重楼色谱峰进行定性鉴别。

2.5 网络药理学分析

2.5.1 重楼化学成分-靶点预测 将重楼提取物表征出来的化合物，采用 Chemspider 数据库 （http：／／www.chemspider.com／Default.aspx），查询活性成分的Canonical SMILES 字符串；将查询到的字符串输入到Swiss Target Prediction 数据库（http：／／www.swisstargetprediction.ch／），从而获得每个成分的潜在靶点。以“lung cancer”为关键词进行检索，以相关性分数（Relevance score＞20）作为筛选条件，得到肺癌的相关靶点。利用网络平台绘制韦恩图 （http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn） 获得成分和疾病的共有靶点。

2.5.2 蛋白-蛋白互作网络构建 运用Cytoscape 3.7.2 软件构建成分靶点网络，以节点表示化合物靶蛋白，边表示化合物-靶点的相互作用，并筛选出靶点数靠前的成分作为重楼治疗肺癌的有效成分。将靶点输入String 数据库，物种选择“Homosapiens”，以Combined score＞0.9 作为筛选条件，得到PPI 网络图，并筛选出治疗肺癌的关键靶点。采用DAVID 6.8 数据库对治疗肺癌的关键靶点进行GO 和KEGG 分析。将KEGG 筛选排名靠前的与抗肺癌相关的信号通路，与重楼活性成分、作用靶点一一对应，构建“成分-靶点-通路” 多维网络图。

3 结果

3.1 重楼化学成分分析 总离子流图见图1，滇重楼化合物鉴定见表1。化合物主要以去质子化离子［M-H］-和醋酸根加合离子［M+HCOO］-离子化形式存在。裂解主要以化合物母核与糖链裂解为主。滇重楼提取物共鉴定出26 个化合物，包括17 个异螺甾烷醇型（9 个薯蓣皂苷型和8 个偏诺皂苷型）、1 个螺甾烷醇型、1 个C21 甾体化合物、2个黄酮类、1 个其他类型。

表1 滇重楼化合物鉴定

图1 滇重楼总离子流图

3.1.1 异螺甾烷醇型 异螺甾烷醇型为重楼皂苷的主要类型，包括薯蓣皂苷型、偏诺皂苷型，17β 位有羟基取代为偏诺皂苷型。该类型化合物一般在5、6 位有双键，3β、7β 有羟基取代，3 位与D-葡萄糖、L-鼠李糖、L-阿拉伯糖等糖链，发生成苷反应。峰2～3、6、13～15、18～19 为偏诺皂苷型。以峰6 和18 为例，进行化合物解析。负离子模式下，峰6 的甲酸根加合离子为m／z1 107.496 0 ［M+HCOO］-，分子离子m／z1 061.489 9 ［M-H］-失去一分子木糖得到碎片离子m／z929.447 0，失去一分子鼠李糖和1个羟基基团得到碎片离子m／z765.373 6，断裂一分子夫糖生成碎片离子m／z619.310 3，失去一分子葡萄糖生成碎片离子m／z439.253 2，得到1 个不含糖链的母核结构，根据化合物结构和质谱裂解碎片，推测峰6 为parisyunnanoside H，质谱图见图2。峰18 分子离子m／z1 029.534 2，连续失去3 个鼠李糖，分别得到碎片离子m／z883.967 2、737.416 3、591.985 8，失去一分子葡萄糖得到碎片离子m／z429.136 3，结合化合物结构、碎片离子、对照品比对，推测峰18 为重楼皂苷Ⅶ。

图2 峰6 一级（A）、二级（B） 质谱图

根据化合物质谱裂解信息，峰7、9～11、22～24 为薯蓣皂苷型。以峰22、24 为例，进行化合物解析。负离子模式下，峰22 分子离子为m／z1 013.535 5，连续断裂3 个鼠李糖，分别得到离子碎片m／z867.482 4、721.417 9、575.358 8，失去一分子的葡萄糖得到离子碎片m／z413.228 8，结合化合物结构、碎片离子、对照品比对，推测峰22 为重楼皂苷Ⅱ，质谱图见图3。峰24 分子离子m／z853.464 5 失去一分子阿拉伯糖得到碎片离子m／z721.418 7，失去一分子鼠李糖得到m／z575.361 9 碎片离子，失去一分子葡萄糖，生成母核结构离子碎片m／z413.082 9。

图3 峰22 一级（A）、二级（B） 质谱图

3.1.2 呋甾烷醇型和C21 甾体 呋甾烷醇型为F 环开环的甾体皂苷，一般在C3-OH、C26-OH 位与葡萄糖成苷。根据化合物结构、裂解碎片信息、文献数据等，推测峰8 和峰12 为呋甾烷醇型皂苷。峰8 分子离子为m／z1 049.525 4，失去两分子鼠李糖和两分子葡萄糖（C3、C26位） 得到母核结构碎片为m／z433.161 7，推测其为重楼皂苷G。峰12 甲酸根加合离子为m／z1 109.547 4，失去一分子鼠李糖得到碎片m／z917.483 0，失去一分子鼠李糖得到m／z755.431 0，失去C3位的葡萄糖产生碎片m／z593.373 0，失去C26位葡萄糖生成碎片m／z431.320 6，根据化合物结构、质谱裂解规律，推断峰12 为重楼皂苷H。C21甾体皂苷为重楼皂苷活性成分，峰4 分子离子为m／z977.430 7，失去一分子鼠李糖生成碎片m／z845.384 3，失去一分子半乳糖生成碎片m／z665.321 2，断裂一分子鼠李糖得到m／z519.260 3，推测峰4 为parisyunnanoside J。

3.1.3 其他 负离子模式下，峰21 分子离子m／z313.240 4 脱去一分子羰基生成碎片离子m／z285.228 4，根据质谱裂解碎片、文献数据对比，可推测为myrincitrin。峰26 分子离子失去一分子鼠李糖和一分子葡萄糖，生成黄酮母核结构碎片离子m／z287.235 4，可推测为7-O-rhakaempferol-3-O-glc。峰1 分子离子m／z479.306 1 脱去一分子水生成碎片离子m／z461.292 1，失去C7H14O4支链结构得到碎片m／z319.195 5，失去一分子C7H14O4和两分子水生成m／z283.170 6，可推测为β-ecdysone。峰17 分子离子脱去一分子葡萄糖生成母核结构m／z348.278 4。

3.2 网络药理学分析

3.2.1 重楼治疗肺癌的关键靶点分析 根据滇重楼化学成分表征，结合相关文献，查询滇重楼中化学成分Canonical SMILES 字符串。得到16 种活性成分，均具有抗肺癌作用，其中 UPLC-Q-TOF-MS／MS 法鉴定得到9 种成分 （βecdysone、重楼皂苷B、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷G、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ），文献查找得到7 种成分（dioscinin、chonglouoside SL-13、chonglousideSL-15、parisyunnanosideA、parisyunnanoside B、parisyunnanoside F、重楼皂苷F）。采用Swiss Target Prediction 平台对16 种活性成分进行靶基因预测，共得到455 个相关靶点，进一步剔除重复靶点后得到靶点344 个。运用GeneCards 数据库筛选与肺癌相关的靶点，共23 470 个。剔除重复的并选择相关性得分大于20 的肺癌相关靶点798 个。将重楼344 个活性成分靶点与798 个肺癌疾病靶点绘制韦恩图（图4），获得滇重楼抗肺癌共性靶点91 个。

图4 滇重楼提取物成分与肺癌靶点韦恩图

3.2.2 活性成分-靶点网络分析 将滇重楼中抑制肺癌作用的16 种活性成分和344 个交集靶点导入Cytoscape 软件，构建成分靶点网络图，见图5。结果显示，共有92 个节点，16 个六边形节点为重楼提取物的16 种活性成分，76 个圆形节点代表与成分对应的潜在相关靶点。采用“NetworkAnalysizer” 分析网络图，得到化合物靶点相关度大小，得到重楼皂苷 VI、重楼皂苷 V、dioscinin、parisyunnanoside F、重楼皂苷I 为相关度较大的成分。

图5 成分-潜在相关靶点网络图

3.2.3 重楼治疗肺癌的关键靶点PPI 网络 将滇重楼抗肺癌靶点基因导入STRING 数据库，查询靶点的相互作用关系，进行可视化分析得到疾病蛋白相互作用网络图，见图6。将Combined score＞0.9 为筛选条件，共得到69 个关键的治疗肺癌靶点。将这69 个靶点与对应的成分进行匹配，按照度值大小进行排序，得到β-ecdysone、dioscinin、重楼皂苷B、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ为贡献较高成分。综合活性成分-靶点分析结果，得到dioscinin、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ为滇重楼治疗肺癌的关键成分。

图6 重楼治疗肺癌潜在靶点的PPI 网络图

3.2.4 重楼治疗肺癌的KEGG、GO 分析 GO 富集分析分为生物过程、细胞组成、分子功能。利用WebGestalt 对69个关键靶点基因进行GO 生物功能标注，分别对前10 个条目进行可视化分析，见图7A。结果表明，生物过程主要涉及酪氨酸多肽磷酸化、酪氨酸多肽修饰、阿米巴型细胞迁移、组织迁移、跨突触信号调节等。细胞组成主要影响膜筏、膜微区、远端轴突、质膜筏。分子功能主要包括蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶活性、蛋白丝氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性等方面。

图7 重楼活性成分GO 生物过程分析（A） 和活性成分-靶点KEGG 通路富集分析（B）

利用WebGestalt 数据库对关键靶点基因进行KEGG 富集分析。由图7B 可知，关键靶点主要富集通路为PI3K-Akt信号通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路、钙离子信号通路、Rap1 信号通路、蛋白聚糖等。

4 讨论

滇重楼提取液化学共鉴定出活性成分26 种，多数为异螺甾烷醇型皂苷，包含薯蓣皂苷型和偏诺皂苷型。研究发现，薯蓣皂苷型重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅴ，偏诺皂苷型重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ，均具有良好的抗肿瘤活性［10-13］，为滇重楼提取液抗肿瘤提供理论支持。中药发挥药效为多成分、多靶点协同作用的结果。中药提取液中包含大量活性成分，那些成分可以发挥协同增效作用。有必要对中药中活性成分，进行整体药效关联分析，寻找具有协同增效的功效成分。

本研究在全面表征滇重楼活性成分的基础上，对活性成分靶点及肺癌相关靶点进行预测，取两者交集进行后续成分-靶点关联分析。筛选出了与功效相关的关键靶点，与靶点相关度较大的成分有dioscinin、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ。研究发现，dioscinin 可抑制肿瘤细胞HeLa、L929、MCF 的增殖，从而发挥良好抗肺癌的作用［14］。重楼皂苷Ⅵ可抑制肿瘤细胞LA795，重楼皂苷Ⅴ可抑制肿瘤细胞HeLa、L929，有效抑制肺癌细胞的增长［15］。结果表明，通过活性成分结合网络药理学方法，可有效筛选具有抗肺癌作用的活性成分，这些成分在调控疾病相关靶点发挥了协同增效的作用。

滇重楼活性成分发挥抗肺癌作用，主要富集通路为PI3K-Akt 信号通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路等。PI3K-Akt 信号通路通过刺激活化PI3K，催化产生磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸，下游靶点Akt 转运至细胞膜上，进一步被磷酸化获得活性，从而发挥调控下游细胞功能。研究表明重楼皂苷Ⅱ能增加PI3K、Akt 磷酸化及mRNA 表达，从而抑制PI3K-Akt 信号通路来抑制重楼肺癌细胞生长［14］。重楼皂苷Ⅶ能够促进AMPK 和Bcl-2 磷酸化，抑制PI3K／Akt／mTOR 磷酸化，从而诱导肝癌细胞HepG2 凋亡［16］。MAPK 信号通路通过上游生长因子与特定受体结合，逐级产生磷酸化反应，促进细胞凋亡。Zhang 等［17］研究发现，重楼皂苷Ⅶ能够增加JNK、ERK、p38 磷酸化水平，通过MAPK 信号通路，抑制肿瘤蛋白p53、PTEN 表达。此外，重楼皂苷Ⅶ通过MAPK 信号通路，抑制炎症细胞因子TNFα、IL-1β、IL-6、一氧化氮合酶、环氧合酶-2 等水平，从而抑制LPS 诱导的RAW264.7 炎性细胞［18］。在Ras 信号通路中，Raf1 作为为主要效应因子并发挥作用，研究证明其通过抑制肿瘤组织中Ras／Raf1 的表达，可有效抑制IL-6 等炎症介质水平。研究表明，重楼皂苷提取物及其单体成分能够有效抑制肺癌细胞的生长。然而，对于Ras 信号通路的相关研究报道较少。

5 结论

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS 技术结合网络药理学明确了重楼抗肺癌的关键活性成分是dioscinin、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅴ。滇重楼活性成分发挥抗肺癌作用主要通过PI3KAkt 信号、Ras 信号、MAPK 信号等通路。通过筛选滇重楼抗肺癌作用的药效物质基础、潜在作用靶点及通路，为滇重楼抗肺癌新药的研发提供理论依据。