乌兰-13 味汤煎煮工艺优化

彩 霞，包啊若汗，吴小花，韩平安，布仁巴图

[1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古民族大学临床医（蒙医） 学院，内蒙古 通辽 028000]

乌兰-13 味汤是蒙医临床常用蒙药复方制剂之一，载自《观者之喜》 第五章收录之“乌兰-13”，《蒙药验方》 《中国医学百科全书·蒙医学》均有记载［1］，由三子汤（诃子、川楝子、栀子）、查干汤（土木香、苦参、山奈、悬钩子木）、四红汤（枇杷叶、紫草、紫草茸、茜草）、橡子、金莲花等13 种单味药材组成，具有清血热功效。汤剂作为蒙成药十大传统剂型之一，具有起效快、容易吸收的特点，但目前有关其煎煮工艺方面的研究尚少，故本实验采用响应面法优化乌兰-13 味汤煎煮工艺，以期为该方煎煮规范提供实验依据。

1 材料

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；EX-H516A 型电子天平（百万分之一） （天津市德安特传感技术有限公司）；XJ220ASCS 型电子天平（上海市天美天平仪器有限公司）；KH-500DE 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；SYG-A2-8 型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；RS-60 型高纯水机（山东新瑞分析仪器有限公司）；N-1300 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；AP-01P 型真空泵（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电热套（上海勒顿实业有限公司）；液相玻璃砂芯过滤装置；1 000 mL 圆底烧瓶；冷凝管；量瓶；量筒；0.22 μm 滤头；0.45 μm 微孔滤膜。

蒙药乌兰-13 味汤由内蒙古民族大学附属医院制剂室提供（批号20201264）。诃子（批号20210120）、紫草茸（批号20201128） 均购于安徽中美堂中药饮片有限公司；栀子（批号20210123）、橡子 （批号2020110）、苦参 （批号20201004）、川楝子 （批号 20200803）、茜草 （批号20200914）、枇杷叶 （批号 20201135）、紫草 （批号20201112）、山柰（批号20191201） 均购于安徽省金芙蓉中药饮片有限公司；土木香（批号20201134） 购于河北国松堂制药有限公司；悬钩子木（批号20170766）、金莲花（批号20160632） 均购于安国市彤康药业有限公司，经专家鉴定为正品。没食子酸 （批号110831-201906，纯度91.5%）、鞣花酸（批号111959-201903，纯度88.8%）、栀子苷（批号ST0333WL0120，纯度97.1%）、京尼平龙胆双糖苷 （ST56070120，纯度≥98%）、荭草苷 （批号D0009173，纯度98.1%）、西红花苷I （ST02900120，纯度≥98%） 对照品均购于中科华检 （北京） 科技有限公司。

甲醇为色谱纯（德国默克公司）；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 各成分含量测定 采用HPLC 法。

2.1.1 色谱条件 Eclipse XDB-C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇-0.1% 磷酸，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长1～10 min 271 nm （没食子酸），10～40 min 235 nm （京尼平龙胆双糖苷、栀子苷），40～58 min 350 nm （荭草苷），58～74 min 255 nm （鞣花酸），74～85 min 440 nm （西红花苷I）；进样量3 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

表1 梯度洗脱程序

2.1.2 干粉制备 取原方药材粉末约15 g，加600 mL 纯水浸泡30 min，加热回流提取3 次，每次90 min，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩至大约100 mL 后水浴锅、烘干箱联合低温烘干，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取“2.1.2” 项下干粉1 g，置于25 mL 棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，密塞，超声处理30 min，甲醇定容至刻度，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.1.4 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，置于棕色量瓶中，甲醇定容至刻度，超声处理3～5 s，摇匀，即得（各成分质量浓度分别为没食子酸0.055 mg／mL、京尼平龙胆双糖苷0.35 mg／mL、栀子苷1.165 mg／mL、荭草苷0.085 mg／mL、鞣花酸 0.045 mg／mL、西红花苷Ⅰ0.035 mg／mL）。

2.1.5 线性关系考察 取“2.1.4” 项下对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下分别进样1、2、3、4、5 μL 测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.1.6 精密度试验 取“2.1.4” 项下对照品溶液适量，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、荭草苷、鞣花酸、西红花苷I峰面积RSD 分别为1.15%、1.14%、1.13%、1.04%、1.00%、0.75%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 取 “2.1.2” 项下干粉1 g，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、荭草苷、鞣花酸、西红花苷I 峰面积RSD 分别为0.72%、0.68%、0.75%、0.79%、1.90%、0.84%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 取 “2.1.2” 项下干粉1 g，按“2.1.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、荭草苷、鞣花酸、西红花苷I 峰面积RSD 分别为0.74%、0.88%、0.79%、1.04%、1.89%、0.57%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率实验 取各成分含量已知的“2.1.2”项下干粉约0.5 g，共6 份，精密加入各对照品适量，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷、荭草苷、鞣花酸、西红花苷I 平均加样回收率分别为 93.38%、100.80%、99.62%、101.24%、102.94%、88.22%，RSD 分别为 0.68%、1.5%、1.21%、1.33%、1.1%、1.22%。

2.2 出膏率、综合评分计算

2.2.1 出膏率 参考2020 年版《中国药典》［4］中的水溶性浸出物热浸法，精密量取原方煎煮汤25 mL，置于恒重蒸发皿中，100 ℃水浴蒸干，放入105 ℃烘干箱中3 h，转移至干燥器中冷却30 min，迅速称定质量，计算出膏率［5］，公式为出膏率＝［（蒸发皿和浸膏总质量-蒸发皿质量） ×煎煮液总体积／煎煮液量取量×全方质量］ ×100%。

2.2.2 综合评分 参考文献［2-3］ 报道，设置总分为100分，其中各指标权重分别为栀子苷含量25 分，京尼平龙胆双糖苷含量20 分，西红花苷I 含量10 分，荭草苷含量10分，没食子酸含量5 分，鞣花酸含量5 分，出膏率25 分，计算综合评分，公式为综合评分＝栀子苷含量／最大栀子苷含量×25+出膏率／最大出膏率×25+京尼平龙胆双糖苷含量／最大京尼平龙胆双糖苷含量×20+荭草苷含量／最大荭草苷含量×10+西红花苷I 含量／最大西红花苷I 含量×10+没食子酸含量／最大没食子酸含量×5+鞣花酸含量／最大鞣花酸含量×5。

2.3 煎煮工艺优化

2.3.1 单因素试验

2.3.1.1 浸泡时间 取原方药材粉末约15 g，共5 份，加入40 倍量水分别浸泡20、30、40、50、60 min 后煎煮60 min，滤过，按 “2.1.2” 项下方法制备干粉，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，按“2.2.2” 项下方法计算综合评分。结果，浸泡30 min 时综合评分最高，并且进一步延长时呈缓慢降低趋势，最终选择20、30、40 min 进行后续考察。

2.3.1.2 加水量 取原方药材粉末约15 g，分别加入20、30、40、50、60 倍量水浸泡30 min 后煎煮60 min，滤过，按“2.1.2” 项下方法制备干粉，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，按“2.2.2” 项下方法计算综合评分。结果，加40 倍量水时综合评分较高，并且进一步增加时仍呈缓慢升高趋势，考虑到服用剂量、顺应性等临床实际情况，最终选择40、50、60 倍进行后续考察。

2.3.1.3 煎煮时间 取原方药材粉末约15 g，共5 份，加入60 倍量水浸泡30 min 后分别煎煮30、45、60、75、90 min，滤过，按“2.1.2” 项下方法制备干粉，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，按“2.2.2” 项下方法计算综合评分。结果，煎煮60 min 时综合评分最高，最终选择45、60、75 min 进行后续考察。

2.3.2 响应面法 结合原方传统用法、患者顺应性、后期开发研究，最终确定煎煮次数为1 次并不再进行优化。在单因素试验基础上，选择浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮时间（C） 作为影响因素，综合评分（Y） 作为评价指标，因素水平见表3，结果见表4。

表3 因素水平

表4 试验设计与结果

采用Design Expert 10.0 软件对表4 数据进行多元线性回归，得方程为Y＝96.97-0.47A+0.27B-1.80C+0.18AB-2.5× 10-3AC-0.15BC-1.70A2-2.73B2-0.80C2（R2＝0.976 2，AdjR2＝0.945 7，PreR2＝0.925 5），表明模型拟合度良好，可用于分析预测，方差分析见表5。由此可知，模型P＜0.000 1，具有高度显著性；失拟项P＞0.05，表明无失拟因素存在；因素C、A2、B2有极显著影响 （P＜0.01），B、C2有显著影响（P＜0.05）；各因素影响程度依次为煎煮时间（C） ＞加水量（B） ＞浸泡时间（A）。

表5 方差分析

响应面分析见图2。最终确定，最优工艺为加水量51.12 倍，浸泡时间29.504 min，煎煮时间45 min，结合临床应用情况、操作可行性，将其修正为加水量51 倍，浸泡时间30 min，煎煮时间45 min。

图2 各因素响应面图

2.3.3 验证试验 按“2.3.2” 项下方法进行3 批验证试验，测得综合评分分别为98.97、97.66、98.35 分，平均值为98.33 分，RSD 为0.67%，与预测值98.015 分接近，表明该工艺稳定可行。

3 讨论

3.1 检测波长选择 本实验采用紫外分光光度计，对各成分进行200～600 nm 全波长扫描，再参照2020 年版《中国药典》 结合相关文献，最终确定最大吸收波长分别为没食子酸271 nm，栀子苷、京尼平龙胆双糖苷235 nm，鞣花酸255 nm，荭草苷350 nm，西红花苷Ⅰ440 nm。

3.2 指标成分选择及其权重分配 乌兰-13 味汤中各单味药占比依次为悬钩子木＞栀子、橡子、紫草茸＞金莲花、诃子、土木香、枇杷叶、苦参、川楝子、茜草＞山奈、紫草，主治血热上盛、头痛、高血压、目赤等［6］。其中，栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、西红花苷Ⅰ均为栀子有效成分，并且该药材在方中的比例较高，为主要清血热成员，同时大量研究表明上述成分具有降压、降脂、抗血栓、神经保护、抗血小板聚集、改善心肌缺血再灌注损伤、保护血管内皮细胞、抗动脉粥样硬化等药理活性，与高血压、高血脂等心血管疾病密切相关［7-12］，但三者含量在煎煮液中差异较大，最终分别赋予25、20、10 分。另外，荭草苷是金莲花有效成分，具有心肌保护、改善脊髓损伤后运动功能、神经保护等作用［13-16］，可能是乌兰-13 味汤治疗萨病（脑卒中） 的重要成分，但其含量偏低，因此赋予10 分；没食子酸、鞣花酸均可作为诃子质量控制的指标成分［17］，具有降压、降糖、抗炎、抗氧化、抗动脉硬化及保护心肌细胞、神经细胞等作用［18-22］，故各赋予5 分；复方制剂出膏率对剂型选择、制备工艺、用药方案等方面均有重要意义，故赋予25 分［23］。