中华蹄盖蕨黄酮提取纯化工艺优化及其成分分析

郭春燕，胡建燃，李 平，安 婕，张峰碧

（1.晋中学院生物科学与技术系，山西 晋中 030619；2.晋中学院山西特色植物资源应用研究中心，山西 晋中 030619）

中华蹄盖蕨AthyriumsinenseRupr.为蹄盖蕨科、蹄盖蕨属植物，生于海拔1 500～2 000 m 山谷林下，在我国华北、东北、西北等地均有分布，以其根茎及叶柄残基入药，具有清热解毒、止血、杀虫等功效［1］。随着人们对蕨类植物化学成分的深入研究，发现其主要活性成分为酚类，其中黄酮类化合物具有极强的抗氧化活性，可以清除人体内的自由基，延缓衰老、预防疾病，除此之外，还具有抗病毒、抗肿瘤、免疫激活等多种药理作用，其在药品、食品行业开发应用潜力巨大［2-3］。

目前，有关蹄盖蕨科植物的研究报道相对较少，主要集中在物种分类、区系、资源调查、形态结构与栽培方面，其中仅对猴腿蹄盖蕨［4-5］等少数蹄盖蕨科植物进行了活性成分提取与分析，还未见中华蹄盖蕨黄酮提取及其组分分析的相关研究。因此，本研究以黄酮得率作为指标，利用单因素和正交试验对中华蹄盖蕨黄酮进行提取，获得最佳的提取条件，并在对提取到的黄酮进行最佳纯化的基础上，采用UPLC-Q-TOF-MS 法对其黄酮成分进行检测与分析，以期为中华蹄盖蕨的深度开发利用提供技术支撑。

1 材料

中华蹄盖蕨采自山西省吕梁市交城县庞泉沟国家级自然保护区，经晋中学院生物科学与技术系植物实验室专家鉴定为正品，阴干至恒重后经微型植物粉碎机粉碎，过60目筛，装入密封袋中备用。芦丁对照品（纯度＞98%，中国食品药品检定研究院）。60～90 目聚酰胺树脂（江苏长丰化工有限公司）；NaNO2、Al （NO3）3、NaOH、无水乙醇、α-萘酚、镁粉、盐酸为分析纯（天津市申泰化学试剂有限公司）；甲酸、乙腈、甲醇为色谱纯（美国Thermo Fisher公司）；水为超纯水。

XS105 分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；AK-060S超声波清洗机（深圳市钰洁清洗设备有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-300V 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ROB50 纯水仪；Neofuge 13R 高速冷冻离心机［力康国际贸易（上海）有限公司］；Evolution 260 Bio 紫外分光光度计 （美国Thermo 公司）；安捷伦1290 Infinity 超高效液相色谱仪、安捷伦6545 UHD and Accurate-Mass Q-TOF 质谱仪（美国安捷伦公司）。

2 方法

2.1 黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 准确称取芦丁对照品20 mg，95%乙醇定容至100 mL，摇匀，得到质量浓度为200 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.2 吸光度测定 吸取对照品溶液2 mL 至10 mL 试管中，加纯净水至5 mL，向试管中加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min，加入0.3 mL 10% Al （NO3）3溶液，摇匀，静置6 min，加入4.4 mL 4% NaOH 溶液，摇匀，静置12 min，以溶剂为空白，在400～600 nm 波长范围内扫描，确定最大吸收波长510 nm 作为检测波长。

2.1.3 标准曲线绘制 向20 mL 试管中加入0、1、2、3、4、5 mL 芦丁对照品，依次加入纯净水、NaNO2溶液、Al （NO3）3溶液、NaOH 溶液，在510 nm 波长处测定吸光度。以对照品质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝0.002 9X+0.003 （R2＝0.999 2），在0～100 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2 黄酮提取 称取1.000 g 中华蹄盖蕨粉末至三角瓶中，按比例加入一定体积分数乙醇，超声（功率380 W） 处理一定时间，待三角瓶中溶液冷却后，用布氏漏斗抽滤保留滤液，离心弃去沉渣，记录所得上清液的体积，测定吸光度，计算得率，公式为得率＝（提取液中黄酮质量浓度×体积×稀释倍数／质量） ×106×100%。

2.2.1 单因素试验 在预实验基础上，设定单因素固定水平为料液比1 ∶20，乙醇体积分数60%，超声温度50 ℃，超声时间30 min；单因素不同水平为料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30，乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%，超声温度40、50、60、70、80 ℃，超声时间10、20、30、40、50 min。

2.2.2 正交试验 根据单因素试验结果，以乙醇体积分数（A）、超声温度（B）、超声时间（C）、料液比（D） 为影响因素，每个因素3 个水平，釆用L9（34） 正交表，因素水平见表1。

表1 因素水平

2.2.3 验证试验 取中华蹄盖蕨60 目干燥粉末3 份，按正交试验所得最优工艺进行提取，测定提取液中黄酮质量浓度，计算得率。

2.3 黄酮纯化

2.3.1 纯化步骤 按照最优工艺提取黄酮，将提取液制成2 mg／mL 溶液。取2.0 g 己预处理好的60～90 目聚酰胺树脂，湿法装入层析柱中，使树脂表面平齐。缓慢加入上样液，用纯净水清洗至流出液不带有颜色，采用Molish 反应判断清洗终点；再用乙醇洗脱，采用盐酸-镁粉反应判断洗脱终点［6］，收集洗脱液，在510 nm 波长处测定吸光度，计算黄酮回收率，公式为回收率＝［（洗脱液中黄酮质量浓度×洗脱液体积）／（上样液中黄酮初始质量浓度×上样液体积）］ ×100%。

2.3.2 纯化条件 取2.0 g 己预处理好的60～90 目聚酰胺树脂，湿法装柱，取2 mg／mL 上样液25 mL，pH 值为5，缓慢上样，控制体积流量为2.0 BV／h，接取流出液，每5 mL为1 份，共5 份，在紫外分光光度计上测定吸光度，计算黄酮含量［7］。

在预实验基础上，设定单因素固定水平为上样液pH值5，上样液质量浓度2 mg／mL，洗脱溶剂60%乙醇，洗脱体积流量2.0 BV／h；单因素不同水平为上样液pH 值3、4、5、6、7，上样液质量浓度1、2、3、4、5 mg／mL，洗脱溶剂50%、60%、70%、80%、90%乙醇，洗脱体积流量1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV／h。

2.3.3 验证试验 取上样液3 份，按最优工艺进行分离纯化，计算回收率。

2.4 黄酮成分测定

2.4.1 样品提取方法 取100 μL 纯化后的黄酮提取液至EP 管中，加入300 μL 甲醇（含5 μg／mLL-2-氯-苯丙氨酸作为内标），涡旋1 min，4 ℃、13 000 r／min 离心10 min，取上清液。

2.4.2 UPLC-Q-TOF-MS 分析条件

2.4.2.1 色谱 Waters XSelect HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.5 μm）；流动相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈 （B），梯度洗脱 （0～2 min，95% A；5.0 min，65%A；15～17 min，35% A；25～30 min，0）；体积流量0.35 mL／min；柱温40 ℃；进样量5 μL。

2.4.2.2 质谱 气体温度325 ℃；干燥气体积流量10 L／min；雾化器压力20 psi （1 psi＝6.895 kPa）；毛细电压3 500 V；碎裂电压120 V；skimmer 电压45 V；采集范围m／z100～3 000。

2.4.3 化合物定性与定量分析 基于自建数据库及化合物信息公共数据库，对质谱检测的一级谱、二级谱数据进行定性分析。化合物结构解析参考HMDB［8］、PubChem、METLIN［9］等已有的质谱公共数据库。

化合物定量是在获得不同样本的化合物质谱分析数据后，在R 软件平台下，使用XCMS 程序包进行峰的识别，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代化合物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正［10］。

2.5 数据处理 采用SPSS 17.0 软件对数据进行ANOVA显著性差异分析（P＜0.05），平行3 次，数据以（±s）表示。

3 结果

3.1 黄酮提取单因素试验 结果见图1。

图1 单因素试验结果

当料液比为1 ∶10～1 ∶25 时，随着乙醇体积增加，黄酮溶解度、得率升高；当料液比小于1 ∶25 时，黄酮得率提高缓慢，说明乙醇过多时可能造成水溶性大极性杂质大量析出，从而影响其得率［11］。

黄酮得率随着乙醇体积分数增加而升高，为60%时最高。虽然乙醇体积分数增加有利于黄酮的浸出，但过高时会降低极性大的化合物溶解度，并且有可能将脂溶性物质提取出来，从而影响其得率［12］。

黄酮得率随着超声温度增加而升高，为60 ℃时最高，超过60 ℃时反而逐渐降低，说明温度对黄酮化合物的影响很大，当温度过低时，黄酮浸出率低，会造成提取不完全；温度过高时，会破坏黄酮类化合物的结构，从而影响其得率［13］。

随着超声时间延长，黄酮得率先升后降，为30 min 时最高。虽然延长提取时间有利于植物细胞壁的分解，黄酮会大量浸出而提高得率，但过长时会导致植物细胞中多糖、蛋白质析出，导致黄酮分解，从而影响其得率［14］。

3.2 黄酮提取正交试验 结果见表2，各因素影响程度依次为D＞A＞C＞B，即料液比最大，超声温度最小；最优工艺为A2B2C1D3，即料液比1 ∶35，乙醇体积分数60%，超声温度60 ℃，超声时间20 min。

表2 试验设计与结果（±s）

表2 试验设计与结果（±s）

试验号 A 乙醇体积分数／%B 超声温度／℃C 超声时间／min D 料液比 得率／%15050201 ∶259.65±0.06 25060301 ∶30 11.10±0.10 35070401 ∶35 14.24±0.04 46050301 ∶35 14.36±0.39 56060401 ∶259.81±0.07 66070201 ∶30 11.61±0.21 77050401 ∶30 10.16±0.17 87060201 ∶35 14.47±0.54 97070301 ∶259.40±0.02 K111.66311.39011.9109.620—K211.92711.79311.62010.957—K311.34311.75011.40314.357—R0.5900.4030.5074.737—

3.3 验证试验 精密称取中华蹄盖蕨60 目干燥粉末1.000 g各3 份，按优化工艺进行提取，测得其黄酮得率为15.01%，可知该工艺稳定可行，重复性好，见表3。

表3 提取工艺验证试验结果（n＝3）

3.4 黄酮纯化 首先对其黄酮水溶液（上样液） 在层析柱上的泄露情况进行初步试验，测定流出液中黄酮质量浓度，进而计算泄漏量。如图2 所示，当上样量达到10 mL时，流出液中含有微量黄酮，说明2.0 g 处理好的60～90目聚酰胺树脂已达到饱和状态，如果继续增加上样量会造成其大量损失。因此，2 mg／mL 黄酮溶液在该条件下的最佳上样量为10 mL。

图2 黄酮泄露曲线

在上样液体积10 mL，处理好的聚酰胺树脂用量2.0 g条件下，分别对上样液pH 值、上样质量浓度、乙醇体积分数、洗脱体积流量进行考察，结果见图3。

图3 各因素对中华蹄盖蕨黄酮回收率的影响

黄酮回收率随上样液pH 值增加而先升后降，当pH 值为3～4 时，由于黄酮类化合物在强酸条件下可能会转变为佯盐，不利于聚酰胺树脂的吸附［15］，因此其回收率较低。当pH 值（pH＞5） 高于黄酮类化合物的pKa值时，它大多以盐的形式存在，不易被吸附，回收率降低；当pH 值为5时，黄酮类化合物以游离形式存在，易被吸附，回收率高。

当上样质量浓度低于2 mg／mL 时，黄酮被充分吸附在聚酰胺树脂上，不利于后期洗脱，导致其回收率较低；为2 mg／mL时，聚酰胺树脂吸附饱和，黄酮回收率最高；大于2 mg／mL 时，黄酮不能完全被吸附［16］，用纯净水冲洗时不仅除去了上样液中的杂质，也会将未被吸附的该成分除去，致使其回收率下降。

黄酮回收率随着乙醇体积分数增加而升高，为70%时最高，此时黄酮极性与70%乙醇相近，有利于其从聚酰胺树脂上解吸下来［17］；但超过70% 时会将大量杂质洗脱下来，导致黄酮回收率有所下降。

当洗脱体积流量为2.0 BV／h 时，黄酮回收率最高；当其加快或减慢时，该成分回收率较低。体积流量缓慢时，洗脱力度不够；体积流量太快时，洗脱时间缩短，黄酮未能被乙醇洗脱下来，导致其回收率降低［18］。

综上所述，最优纯化工艺为上样液pH 值为5，上样质量浓度2 mg／mL，70%乙醇洗脱，洗脱体积流量2.0 BV／h。

3.5 黄酮纯化条件的验证 取10 mL 2 mg／mL 上样液各3份，按优化工艺在装有2.0 g 处理好的聚酰胺树脂层析柱上进行验证试验，结果见表4，可知该工艺稳定可行。另外，纯化后的溶液经减压浓缩、冷冻干燥后，粉末中黄酮含量为70.32%，比纯化前提高25.64%。

表4 纯化工艺验证试验结果（n＝3）

3.6 黄酮成分分析 在负离子模式下，黄酮类化合物得到了较好的分离，见图4，结合质谱数据鉴定出其中9 个色谱峰所对应的化合物。由表5 可知，中华蹄盖蕨含有针依瓦菊素、没食子儿茶素、樱桃苷-4″，6″-二-O-没食子酸酯、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、黄芪黄酮、棕鳞矢车菊黄酮素、洋槐黄素、3-羟基-8，9-二甲氧基香豆雌酚、肉豆蔻酚C 这9 种黄酮类化合物，其中黄芪黄酮、针依瓦菊素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量较高。

图4 中华蹄盖蕨黄酮TIC 色谱图

表5 中华蹄盖蕨黄酮鉴定结果

4 讨论

本研究采用超声波辅助乙醇法对中华蹄盖蕨黄酮进行提取，在最佳提取条件下，中华蹄盖蕨黄酮的得率为15.01%。本实验结果与同属猴腿蹄盖蕨黄酮得率接近［20］，表明该提取方法及条件准确、可行。黄酮提取液经聚酰胺树脂层析纯化后，所得干粉中黄酮纯度提高了25.64%，说明聚酰胺树脂对中华蹄盖蕨黄酮具有良好的吸附性，可有效纯化其黄酮。超声波辅助乙醇提取法与聚酰胺树脂纯化法不仅具备操作简单、设备成本低、效率高、稳定性佳等优点，而且所得黄酮产品纯度高，无重金属、有机溶剂等毒性物质的残留［21］。从结果来看，这2 种方法是目前黄酮提取纯化较好的方法。

UPLC-Q-TOF-MS 法对复杂样品具有高分离能力、高选择性、高灵敏度、可提供相对分子质量与结构信息等优点，被广泛应用于化学成分的解析中［22-23］。本研究首次采用该技术分析中华蹄盖蕨黄酮的主要成分。通过色谱的分离及质谱的检测，鉴定出中华蹄盖蕨9 个色谱峰的化学成分，其中黄芪黄酮、针依瓦菊素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷含量较高。由于蕨类植物活性成分相关研究较少，目前仅发现猴腿蹄盖蕨、剑叶凤尾蕨和阔叶凤尾蕨含有槲皮素-7-O-葡萄糖苷，其他8 种黄酮类化合物未见报道。中华蹄盖蕨黄酮成分复杂，还有待于进一步的深入解析。