低共熔溶剂对黄连中生物碱绿色提取工艺的优化

仝洺慧，朱 越，李佳凝，王 慧，何 妍，王一男

（徐州医科大学新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004）

黄连为毛莨科植物黄连CoptischinensisFranch.的根茎，具有保护心脑血管、降血糖、抗炎、抗肿瘤等作用，其主要药用成分为生物碱类［1-3］。2020 年版《中国药典》 规定，黄连碱、黄连素、巴马汀等为黄连指标性成分［4］。传统萃取黄连中生物碱的方法有超声波法、回流法、冷浸法、辅助酶法等［5-7］。存在萃取效率不高、萃取时程过长且环境不友好等缺点，因此探寻一种绿色、高效的黄连生物碱萃取技术成为当务之急。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；AB265-S 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；VS-Tenoe 扫描电子显微镜（美国FEI 公司）；IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司）；BT25S 电子分析天平［赛多利斯（北京） 生物科技有限公司］；TGL-16C离心机（上海安亭仪器有限公司）；B-220 数显恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；KQ-500E 超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；DHG-9240A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 黄连购自徐州市康源大药房，批号190903，经徐州医科大学张春平副教授鉴定为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎。盐酸巴马汀（货号S0422AS，纯度≥99.9%）、黄连素（货号F0126AS，纯度≥99.9%）、药根碱（货号S0913AS，纯度≥99.9%） 对照品，氯化胆碱、甜菜碱、脯氨酸、葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素为分析纯（大连美仑生物技术有限公司）。甲醇（美国Fisher 公司）；冰醋酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为纯化水。

2 方法

2.1 低共熔溶剂制备 取氯化胆碱、甜菜碱、葡萄糖、果糖、柠檬酸、苹果酸、甘油、乳酸、木糖醇、尿素适量，按照一定比例置于烧杯中，并加入固定比例的水以降低黏度，在80 ℃水浴下加热并搅拌，直至烧杯中形成均一的液体，冷却转移，避光保存。初次共合成10 组低共熔溶剂，见表1，氢键受体-氢键供体比例1 ∶2，含水量20%。

表1 低共熔溶剂类型

2.2 低共熔溶剂对黄连生物碱成分的提取 取黄连适量干燥30 min，用球磨粉碎机粉碎15 min，粉末过80 目筛，精密称取黄连粉末250 mg，置于15 mL EP 管中，加入一定体积配置好的低共熔溶剂10 mL，混合均匀后，超声提取30 min，待EP 管中溶液冷却至室温，将溶液转移至离心管内，13 000 r／min 离心10 min，取上清液，即为黄连粗提取液。同法采用甲醇、水对黄连中的生物碱成分进行提取。

2.3 低共熔溶剂的红外光谱扫描 低共熔溶剂单体和合成后的溶剂通过KBr 压片法或KBr 薄片直接测定法进行红外光谱扫描，波长扫描范围4 700～340 cm-1；扫描次数20；变迹函数Happ-Genze。

2.4 黄连粉末提取前后扫描电子显微镜检测 取不同溶剂提取后的黄连粉末，分散后载于测试铜板上，采用扫描电子显微镜（SEM） 观察黄连粉末经过提取前后的显微结构变化。

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件 Universil XB C18色谱柱 （150 mm×4.6 mm，3 μm）；流动相2 mmol／L 三乙胺（pH＝9.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～30 min，25%～70%B）；体积流量0.5 mL／min；柱温30 ℃；检测波长270 nm；进样量2 μL。

在描述和学校的关系时，59.03%的大学生持积极情感态度，以强调学校给其带来的轻松、愉悦的情感体验为价值取向；而40.97%的大学生则持消极情感态度，以强调学校给其带来的禁锢、痛苦的情感体验为价值取向，所占比例较大。

2.5.2 对照品溶液制备 精密称取药根碱、巴马汀、黄连素对照品适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1.0 mg／mL 的贮备液，精密量取适量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含药根碱（2、5、10、50、80、100 μg／mL）、巴马汀（4、10、20、100、160、200 μg／mL）、黄连素 （20、50、100、500、800、1 000 μg／mL） 的溶液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.5.3 供试品溶液制备 取“2.2” 项下粗提取液适量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，加水稀释5 倍，即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性考察 取对照品、供试品溶液适量，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，药根碱、巴马汀、黄连素与其他成分均达到基线分离，并且分离度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.6.2 线性关系考察 取“2.5.2” 项下对照品溶液适量，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，以S／N＝3时的质量浓度为检出限，S／N＝10 时的质量浓度为定量限，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.6.3 精密度试验 取“2.5.2” 项下对照品溶液适量，质量浓度分别为药根碱50 μg／mL、巴马汀80 μg／mL、黄连素400 μg／mL，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得药根碱、巴马汀、黄连素峰面积RSD 分别为1.52%、1.42%，1.18%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取黄连粉末的甜菜碱-乳酸（1 ∶3）提取液，平行6 份，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，测得药根碱、巴马汀、黄连素含量RSD 分别为2.18%、2.51%、2.01%，表明该方法重复性良好。

2.6.5 加样回收率试验 精密量取各成分含量已知的甜菜碱-乳酸（1 ∶3） 低共熔溶剂9 份，加入“2.5.2” 项下对照品溶液适量，按“2.5.3” 项下方法制备低、中、高水平（80%、100%、120%） 供试品溶液各3 份，在“2.5.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，药根碱回收率为97.7%～102.7%，RSD ≤2.2%；巴马汀回收率为97.9%～98.8%，RSD≤2.3%；黄连素回收率为98.2%～100.1%，RSD≤2.1%。

3 结果

3.1 低共熔溶剂选择 以药根碱、巴马汀、黄连素总含量为计算指标，比较不同低共熔溶剂与传统溶剂提取效率的差异，结果见图2。由此可知，甜菜碱-乳酸（1 ∶2） 提取总生物碱含量的效率最高，且高于传统的甲醇、水提取的方法，所以选取甜菜碱-甘油为提取黄连总生物碱的低共熔溶剂。

图2 黄连中总生物碱成分经过不同溶剂提取后的总含量

3.2 单因素试验

3.2.1 低共熔溶剂比例 筛选出提取率最高的低共熔溶剂甜菜碱-乳酸后，合成不同比例的低共熔溶剂（1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4）。随着甘油比例升高，提取生物碱的量升高，在1 ∶4 时下降，结果见图3A。因此，选择甜菜碱与乳酸比例1 ∶3 作为最佳水平。

图3 单因素试验结果

3.2.2 低共熔溶剂含水量 含水量具有调节低共熔溶剂黏度、极性作用［11-12］。固定提取时间30 min，料液比15 ∶1，考察不同比例水（0、10%、20%、30%、40%） 对黄连生物碱提取率的影响，结果见图3B。随着水比例增加生物碱含量升高，在30%时最高，再增加时反而下降。因此，选择30%作为水比例最佳水平。

3.2.3 料液比 低共熔溶剂的体积大小决定了药材粉末是否能充分浸润、目标化合物能否有效溶出［13］。固定水比例20%，提取时间30 min，考察不同料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30） 对黄连生物碱提取率的影响，结果见图3C。随着料液比增加，药材充分浸润，生物碱提取率不断升高，在1 ∶20 时达到最大值，再增加时变化不大。因此，选择1 ∶20 作为料液比最佳水平。

3.2.4 提取时间 在一定时间段内，活性成分溶出率随着时间的增加而增加，然而达到一定时间后，溶液体系渗透压达到平衡时溶出率变化不大［14-15］。固定提取水比例30%，料液比20 ∶ 1，考察不同提取时间 （10、20、30、40、50 min） 对提取率的影响，结果见图3D。在30 min 内，生物碱提取率随着提取时间延长而增加，继续延长时无明显变化。从节省时间和能源角度考虑，选择30 min 作为提取时间最佳水平。

综上所述，同等条件下实验中合成的低共熔溶剂对黄连中生物碱类化合物的提取优于传统的水提取法、醇提取法。经过提取试验优化，黄连总生物碱优化后的最终提取工艺为甜菜碱与乳酸比例1 ∶3，低共熔溶剂含水量30%，料液比1 ∶20，提取时间30 min。

3.3 低共熔溶剂的红外光谱扫描 对甜菜碱通过KBr 压片法进行红外光谱扫描，乳酸与合成的甜菜碱-乳酸低共熔溶剂采用KBr 薄片直接测定法进行红外光谱扫描，结果见图4。

图4 低共熔溶剂成分红外光谱图

由此可知，在低共熔溶剂红外谱中均可观察到甜菜碱和乳酸的特征吸收峰。乳酸可观察到较宽的O-H 伸缩振动吸收峰。甜菜碱-乳酸（1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4） 的O-H 伸缩振动分别为3 389、3 381、3 377 cm-1，羟基基团的红外特征波长发生位移表明合成的甜菜碱-乳酸低共熔溶剂中氢键的形成。甜菜碱-乳酸（1 ∶3） 的羟基吸收峰比其他组的吸收峰更宽、强度更强，表明甜菜碱-乳酸（1 ∶3） 中氢键形成的数量最多。

3.4 黄连提取前后SEM 检测 未经提取的黄连粉末可观察到较为完整的黄连粉末颗粒结构（图5A）。经过不同溶剂作为溶出介质的超声提取后，黄连粉末颗粒遭到不同程度的破坏。黄连植物细胞和细胞壁破坏越严重，则黄连中有效成分释放越多。经过甲醇提取后，黄连粉末颗粒表面可观察到致密细孔（图5B）；经过水提取后，黄连粉末颗粒表面可观察到较为疏松的细孔（图5C）；经过甜菜碱-乳酸（1 ∶3） 提取后，黄连粉末颗粒破坏较为严重，可观察到较大空洞（图5D）。

图5 黄连粉末提取前后扫描电镜图

4 结论

低共熔溶剂作为一种新型类离子溶剂，它的熔点明显低于各组分物质的熔点，大多数季铵盐与氢键供体形成的低共熔溶剂的密度通常略大于水的密度，且低共熔溶剂的挥发性低，被萃取的物质相对而言难于挥发，热稳定性好，具有超分子结构，红外图谱证实低共熔溶剂分子间存在较强的氢键并能与水发生强烈作用，对极性和弱极性物质溶解性强于普通溶剂。同时，低共熔溶剂与多数离子液体类似，具有低饱和蒸汽压并且能够调节物质的选择性和极性，因此，在提取黄连中生物碱类化合物时，能提高溶解度，在超声辅助下能增强植物细胞壁的破坏力，比水提取法和醇提取法的效率更高。且低共熔溶剂的黏度随着温度的降低而升高，合成时温度下的黏度高于室温下的黏度，甜菜碱与乳酸按1 ∶3 比例合成的低共熔溶剂在室温下比其它的低共熔溶剂较低，液体流动性较好，因此在提取效率上比合成的其它低共熔溶剂的提取效率高。

本研究以用氯化胆碱、甜菜碱、脯氨酸为氢键受体，D-果糖、柠檬酸、L-苹果酸、甘油、DL-乳酸、木糖醇、尿素为氢键供体合成的低共熔溶剂，对黄连中生物碱类化合物进行提取，同时与水提取法和醇提取法进行了对比。通过HPLC 法进行提取物的含量测定，红外光谱对合成的低共熔溶剂的官能团进行表征，同时通过单因素考察比较低共熔溶剂两组分摩尔比例、提取时的时间、低共熔溶剂含水的比例、料液比对黄连生物碱提取效率的影响。黄连总生物碱优化后的最终提取工艺为甜菜碱与乳酸比例1 ∶3，低共熔溶剂含水量30%，料液比1 ∶20，提取时间30 min。

实验结果表明，合成的低共熔溶剂对黄连中生物碱类化合物的提取优于传统的水提取法和醇提取法。且合成的低共熔溶剂绿色，快速便捷，成本比传统离子溶剂低，应用前景更为广阔。因此，低共熔溶剂可用于对黄连中生物碱类化合物的提取。