HPLC-MS／MS 法同时测定白头翁汤中13 种成分及其配伍前后含量变化

谭小青，丘海芯，高红伟，唐红珍，覃喜军，刘振杰*

（1.广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁 530022；2.广西中医药大学，广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西 南宁 530299）

白头翁始载于《神农本草经》，是毛茛科植物白头翁Pulsatillachinensis（Bge.） Regel 的干燥根，具有清热解毒、凉血止痢功效［1-2］，临床上主要用于治疗急性菌痢［3-4］、溃疡性结肠炎［5-6］、肿瘤［7-10］等疾病。白头翁汤组方包括4 味中药，分别是君药白头翁、臣药黄连和黄柏、使药秦皮［11］，皂苷、生物碱、香豆素、黄酮、柠檬苦素、甾醇、木脂素为其主要有效成分［12-13］。贾娅倩等［14］采用HPLC法对白头翁汤中6 种指标成分含量进行测定，朴美憬等［15］采用HPLC 法结合紫外法测定白头翁汤中白头翁皂苷B4 含量，时维静等［16］采用正交试验对白头翁汤提取工艺进行优化，再采用HPLC 法测定小檗碱含量。

前期报道，白头翁汤含量测定方法主要是HPLC 法、分光光度法，测定成分主要是生物碱、香豆素，而对君药白头翁活性成分白头翁皂苷的研究较少，也尚未对该方进行整体质量评价。因此，本实验采用HPLC-MS／MS 方法同时测定白头翁汤中白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱的含量，并考察其配伍前后变化，以期为该方及其相关制剂的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 Xevo TQ-XS 超高效液相色谱／三重四级杆串联质谱联用仪，配置电喷雾离子源（ESI）、Analyst 数据处理系统，购自美国Waters 公司；Genius NM32LA 氮气发生器，购自英国 Peak Scientific 公司；SQP 电子天平（十万分之一），购自赛多利斯科学仪器 （北京） 有限公司；Centrifuge5424R 离心机，购自德国Eppendorf 公司。

1.2 试剂与药物 白头翁皂苷 B4 （批号PS010748）、白头翁皂苷B5 （批号PS010727）、黑海常春藤皂苷A1 （批号PS001149）、白头翁皂苷D （批号PS190923-03）、白头翁皂苷A3 （批号PS011161）、α-常春藤皂苷（批号PS000085）、秦皮甲素 （批号 PS011025）、秦皮乙素 （批号PS011505）、秦皮素（批号PSOOO762）、黄柏碱（批号PS000447），盐酸巴马汀（批号PS020011）、盐酸黄连碱 （批号PS190923-04），盐酸小檗碱（批号PS001003） 对照品均购自成都普思生物科技股份有限公司（纯度≥98%）。乙腈为色谱纯；甲醇为分析纯；水为饮用水，购自屈臣氏集团（香港） 有限公司。

1.3 药材 白头翁、黄连、黄柏、秦皮购自全国各地，批号见表1，经广西中医药大学许琼明教授鉴定，白头翁为毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis（Bge.） Regel 的干燥根，秦皮为木犀科植物白蜡树FraxinuschinensisRoxb 的干燥枝皮［17-18］，黄连为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch 的干燥根茎，黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron siniiY.C.Wu 的干燥树皮［19］，按2020 年版《中国药典》 一部标准检测均合格。

表1 白头翁汤药材批号Tab．1 Batches of medicinal materials in Baitouweng Decoction

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱对照品适量，甲醇溶解，即得（各成分质量浓度分别为28.2、19.8、33、23、20.8、23.4、48、41、29.2、22.4、27.8、21.4、32.2 ng／mL），保存于4 ℃冰箱中。

2.2 供试品溶液制备 取白头翁、黄柏、黄连、秦皮适量，除去杂质，切碎，本实验用药量按《伤寒论》 处方药量减半。

2.2.1 白头翁 取药材6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，滤过，继续加8 倍量水微沸1 h，滤过，合并滤液，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，50%甲醇稀释定容至100 mL 量瓶中，即得，同法制备4 份。

2.2.2 白头翁汤 取白头翁6 g、黄柏4.5 g、黄连3 g、秦皮6 g，加10 倍量水浸泡30 min，微沸1 h，滤过，继续加8 倍量水微沸1 h，滤过，合并滤液，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，50%甲醇稀释定容至250 mL 量瓶中，即得，同法制备4 份。

2.2.3 缺白头翁阴性汤 取黄柏4.5 g、黄连3 g、秦皮6 g （除去白头翁），其他操作同 “2.2.2”项，即得，同法制备4 份。

2.3 色谱条件 ACQUITY UPLC ® BEH C18色谱柱 （2.1 mm× 50 mm，1.7 μm）；流动相甲醇（A）-0.1% 甲酸 （B），梯度洗脱 （0～0.5 min，10% A；0.5～2 min，10%～90% A；2～4 min，90%A；4～6 min，90%～10% A）；体积流量0.2 mL／min；柱温24.5 ℃；进样量2.0 μL。

2.4 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压3.0 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度550℃，体积流量1 000 L／h；锥孔气体积流量50 L／h；正负离子扫描；多反应监测（MRM） 模式，其他参数见表2。

表2 各成分质谱参数Tab．2 Mass spectrum parameters for various constituents

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 取对照品、供试品溶液各1份，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，2 种溶液在同一出峰时间均出现各成分色谱峰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC-MS／MS 图Fig．1 HPLC-MS／MS spectra for various constituents

2.5.2 线性关系考察 取对照品溶液适量，50%甲醇稀释成系列质量浓度，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并以S／N＝3 时的质量浓度为检测限，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab．3 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度试验 取“ 2.5.1” 项下对照品溶液适量，在“2.3”“2.4” 项条件下进样测定6 次，测得白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱峰面积RSD 分别为5.5%、6.9%、2.9%、9.6%、4.2%、4.8%、1.6%、1.1%、1.5%、0.6%、0.4%、0.3%、0.6%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取白头翁汤供试品溶液（B1） 适量，室温下于0、6、12、18、24 h 在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，测得白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱峰面积RSD 分别为3.3%、7.1%、5.1%、2.1%、10.3%、11.2%、10.0%、7.3%、3.7%、2.1%、0.4%、1.2%、0.9%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取白头翁汤（B1） 6 份，按“ 2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，测得白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱峰面积RSD 分别为2.8%、3.1%、1.4%、12.6%、9.2%、8.1%、5.1%、4.8%、3.6%、1.0%、3.3%、2.6%、1.0%，表明该方法重复性良好。

2.5.6 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的白头翁汤（B1） 6 份，分别加入100%水平对照品溶液1 mL，按“ 2.2.2” 项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱平均加样回收率分别为106.2%、105.6%、99.7%、101.9%、98.3%、101.1%、103.5%、100.0%、93.9%、102.5%、98.9%、97.9%、94.4%，RSD 分别为3.1%、2.3%、1.9%、1.1%、3.3%、1.5%、2.9%、1.6%、3.8%、4.2%、3.2%、4.1%、2.6%。

2.6 样品含量测定 取白头翁、白头翁汤、缺白头翁阴性汤适量，按“ 2.2” 项下方法各平行制备4 份供试品溶液，在“2.3” “2.4” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（n＝6）Tab．4 Results of content determination of various constituents （n＝6）

2.7 配伍前后含量变化分析 图2 显示，白头翁中白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5 含量均高于白头翁汤中；单糖类皂苷α-常春藤皂苷、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷A3 含量在白头翁中较高，以白头翁皂苷A3 含量更明显，而白头翁皂苷D 含量在白头翁汤中较高；缺白头翁阴性汤中秦皮甲素、黄柏碱、巴马汀等生物碱含量均高于白头翁汤中，而白头翁汤中秦皮素、秦皮乙素含量更高。

图2 不同样品中各成分含量变化Fig．2 Changes in contents of various constituents in different samples

图3 显示，白头翁汤中双糖类皂苷（白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5） 含量约为白头翁中的1／5，单糖类皂苷（黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷） 含量约为白头翁中的1／2，即合煎时皂苷含量低于单煎时；缺白头翁阴性汤中香豆素（秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素） 含量约为白头翁汤中的1／3，而白头翁汤中生物碱（黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱）约为去头翁汤的1／2，即单煎时香豆素含量低于合煎时，而生物碱含量更高。

图3 不同种类成分含量变化Fig．3 Changes in contents of different kinds of constituents

3 讨论

为了减少提取时气泡的产生，本实验在提取前先将药材浸泡30 min 后再加热。由于流动相为甲酸时峰形更理想，故选择其作为流动相。在正离子模式下，黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱、白头翁皂苷B5 有响应，而其他8 种成分在负离子模式下有响应。另外，本实验所用试剂或样品本身含有Na+，导致待测成分也产生了相关离子峰，通过仪器调谐功能进行正负离子调谐，发现白头翁皂苷B5 正离子有很好的响应值，故选择该模式作为其检测方式。

前期报道，处方中药材单煎、合煎可能改变其成分种类和含量［20-23］。本实验采用HPLC-MS／MS法分别对白头翁、白头翁汤、缺白头翁阴性汤中各成分含量进行测定，发现合煎会导致皂苷、生物碱类成分溶出量降低，香豆素类成分溶出量升高，推测可能是因为前2 类成分结合生成其他化合物而导致其溶出减少，而白头翁汤中其他药材可增加后一类成分溶出。

4 结论

本实验采用HPLC-MS／MS 法同时测定白头翁汤中白头翁皂苷B4、白头翁皂苷B5、黑海常春藤皂苷A1、白头翁皂苷D、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、秦皮素、秦皮甲素、秦皮乙素、黄柏碱、巴马汀、黄连碱、小檗碱的含量，并考察配伍前后其变化，该方法简便可行，试剂消耗少，检测时间短，对该方质量控制有一定参考价值。