CRISPR-Cas12a在病原检测中的应用进展

王 亮，宋 毅，苗立中，撒瑞雪，常维山

（1.山东省淄博市博山区农业农村局，山东 淄博 255000；2.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐；3. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州；4.山东农业大学动物科技学院，山东 泰安）

在自然环境中，许多微生物和寄生虫病原可引起严重疾病，威胁人畜的生命健康，造成重大经济损失，因此对病原的早期快速诊断尤为重要。在分子生物学中，聚合酶链式反应（PCR）是分子诊断的最佳选择，其利用DNA高温变性、低温复性和聚合酶在最适温度下延伸来实现扩增，然而，该方法需要专业人员、昂贵仪器和实验室环境，且耗时较长，限制了其在现场的应用。近年来，依赖于等温核酸扩增技术的快速检测方法也已引起了人们越来越多的关注，常见的等温扩增技术包括环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、重组酶介导等温扩增（RAA）等。随着对Cas研究的不断深入，研究人员试图将Cas作为生物传感器与核酸扩增技术相结合，推出简单、快速、适合现场检测的病原检测方法[1-3]。RAA技术结合在病原检测方面取得的进展，以期为后续探索CRISPR-Cas12a系统与核酸扩增技术结合后用于病原检测提供理论参考。

1 CRISPR-Cas12a系统的检测原理

迄今为止，没有任何一种检测方法同时符合敏感、特异、快速、操作简单、不需复杂仪器等要求，因此，需要不断开发新的、更有效的分子诊断方法。本文回顾了CRISPR-Cas系统和CRISPR-Cas12a系统的作用原理，讨论了近几年来CRISPR-Cas12a系统与PCR、LAMP、RPA及CRISPR-Cas系统是广泛存在于古细菌和细菌中的一种获得性适应性免疫系统[4]，由成簇的规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）和相关蛋白（CRISPR-associated protein, Cas）组成。根据CRISPR-Cas系统干扰阶段效应蛋白的不同，将该系统分为两大类。1类系统包括I、III和IV型，2类系统包括II（Cas9）、V（Cas12a、Cas12b、Cas14a）和VI（Cas13a）型[5-7]。2类系统中不同亚型的Cas蛋白靶向不同的核酸，Cas12不需要额外步骤即可直接识别靶DNA，因此Cas12常被用于DNA检测[8]，其中Cas12a（Cpf1）的应用较为广泛。CRISPR-Cas12a系统包含Cas12a蛋白和较短的CRISPR RNA（crRNA）[9]。与Cas9不同，Cas12a在将precrRNA加工成成熟crRNA的过程中不需要RNA或其他蛋白质的辅助，也不需要RNaseIII[10]，因此Cas12a可以在tracrRNA的情况下实现对靶序列的切割。Cas12a通过单个crRNA识别dsDNA后，RuvC和Nuc核酸内切酶结构域诱导非靶向链（NTS）和靶向链（TS）中的DNA交错断裂[11]。Cas12a在crRNA的引导下识别并解链富含T（TTTN）的PAM的dsDNA。解链后，dsDNA中的靶链（TS）与crRNA互补配对，引起构象变化，暴露RuvC位点，RuvC位点先切割NTS，再切割TS，这被称为Cas12a的顺式切割活性。切割后，Cas12a-crRNA复合物保持与TS结合，并释放切割产物，使仍有活性的RuvC位点暴露并与ssDNA结合而发挥反式切割活性（图1）。因此，通过设计与靶序列互补的crRNA，可以保证Cas12a的特异性。然后，结合荧光探针或免疫层析技术，即可实现核酸检测。

图1 Cas12a-crRNA交错切割[6]

2 CRISPR-Cas12a用于病原检测

2.1 CRISPR-Cas12a与PCR结合用于病原检测

PCR可在2～3 h内扩增任何DNA片段，是常用的体外核酸扩增技术，由于其许多优点和进一步的改进，已成为检测、诊断和实验室研究的基本工具。便携式PCR热循环仪问世以后，该技术结合CRISRP-Cas12a对多种病原的检测工作随即广泛开展。其原理为PCR扩增靶序列后，crRNA引导Cas12a蛋白与靶序列结合并激活Cas12a蛋白的反式切割活性，对体系内ssDNA报告分子进行无序切割，结合紫外灯照射或免疫层析技术即可观察检测结果。Li等将淬灭荧光ssDNA报告探针与PCR扩增相结合，开发了用于快速检测靶DNA和RNA的HOLMES检测平台[12]。尽管样品中未扩增的靶DNA作为激活剂，可直接用于基于CRISPR-Cas12a的核酸检测，但其最低检测浓度为0.1 nmol/L，而与PCR结合后，检测浓度可低至10 amol/L。

为防止PCR扩增产物被气溶胶污染，Zhang等设计了一种针对副溶血性孤菌（Vibrio parahaemolyticus, VP）的单管检测方法，即在试管盖内预先加入20 µL CRISPR试剂，同时在试管底部加入25 µL PCR混合物，用50 µL矿物油覆盖，PCR扩增后，通过离心将CRISPR试剂与PCR扩增产物混合[13]。该方法对VP DNA的检出限为1.02×102拷贝/µL，且特异性高，避免污染，降低了假阳性结果的可能，因此不仅适用于病原检测，在食品安全分析和医学诊断等许多领域均具有应用潜力。

2.2 CRISPR-Cas12a与LAMP结合用于病原检测

1998年，日本荣研化学株社会社设计了一种环介导等温扩增（LAMP）DNA的方法，可在1 h内扩增产生多达109个拷贝的DNA。该方法利用两到三对引物（内部、外部和环引物），具有较强特异性，可识别DNA或RNA靶标上多达8个特异性位点。此外，LAMP中常用的Bst DNA聚合酶的高置换活性消除了DNA的变性阶段，使其可以在干燥加热器或培养箱等稳定的温度下进行。

Lei等通过CRISPR-Cas12a与LAMP结合建立了一种针对猪圆环病毒2型（PCV2）的检测方法，该方法对PCV2的检测可以在1h内达到1.0×100拷贝/µL的检出限，为断奶仔猪多系统衰弱综合征（PMWS）的预防和治疗争取了宝贵的时间[14]。研究人员还提供了在原核表达系统中表达huLbCas2a蛋白的最佳方案，包括温度、时间等重要参数和使用镍固定金属亲和色谱法洗脱纯化蛋白的最佳缓冲液，这些努力不仅降低了检测的成本，并为现场检测提供了有益的参考。

Nang等开发并验证了一种基于RT-LAMP耦合CRISPR-Cas12系统快速检测丙型肝炎病毒（HCV）RNA的检测方法，该方法的特异性为100%，对感染HCV样品的最低检测浓度为10 ng/µL，通过测流条带或荧光测量观察检测结果，可部署在医院检测点，以识别HCV感染者[15]。RT-LAMP与CRISPR-Cas12a系统的组合通过反式切割活性进行信号扩增，提高了试验的灵敏度。同时Cas12a-crRNA复合物可以区分核苷酸错配，使得RT-LAMP与CRISPR-Cas12系统组合比单独使用LAMP检测更具有特异性。

2.3 CRISPR-Cas12a与RPA结合用于病原检测

近年来，RPA技术被开发用于病原的快速检测，由于其操作简单，不需要复杂的设备，正在逐渐取代传统的PCR技术。与LAMP相比，RPA的引物设计简单，反应可在室温下进行，因此RPA更适合用于病原的现场检测。

Chen等将CRISRP-Cas12a与RPA技术结合，创立了一种被称为DNA内切核酸酶靶向CRISPR反式报告基因（DETECTR）的检测方法，该方法检测样品中人乳头瘤病毒（HPV）的灵敏度达到阿摩尔级，展示了从临床样本中检测病毒的强大能力，为分子诊断技术提供了一个崭新的平台[16]；在此基础上许多后续研究建立了更完善检测方法，如基于RPA和Cas12a侧枝切割的活性，开发了用于迅速检测RNA和DNA标靶的HOLMES[17]。基于Chen等的设计思路，Jiang等开发了一种新的检测VP-tdh和VP-trh基因的方法，即RPA-CRISPR-Cas12a-VP，该方法可在30 min内准确检测10-18mol/L的靶DNA（单分子检测），并能准确分析浓度低至102CFU/g的样品[18]。

在CRISPR之前进行RPA等温扩增，可以提高检测的灵敏度[19]，且RPA与CRISPR系统均在37 ℃至42℃下反应，因此可以轻易将两者整合成功[20-21]。然而，两个系统需要两步反应，打开盖子的中间操作可能产生气溶胶污染，因此，Li等设计了单管RPA-CRISPR-Cas12a方法来快速、灵敏和无污染的检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），并采用了3种可视化方法来呈现MRSA的检测结果：实时荧光、可见终点荧光和侧流条带。整个检测过程在15～20 min内完成，不会因开盖造成污染，不需要昂贵的仪器，仅需要1个小型离心机、1个热培养箱和1个紫外灯就可以进行测试，其灵敏度与qPCR相当，具有应用于即时检验（POCT）的潜力[22]。

2.4 CRISPR-Cas12a与RAA结合用于病原检测

重组酶辅助等温扩增依赖于3种酶：重组酶UvsX（E. coli）、单链DNA结合蛋白（SSB）、DNA聚合酶。UvsX与特异性引物结合形成UvsX-引物复合物，并与基因组中的同源序列配对，配对成功后发生链置换反应，SSB与产生的置换ssDNA结合，防止立即形成dsDNA，然后通过DNA聚合酶实现延伸，在39 ℃下20～30 min内完成扩增[23]。

Li等将双链重组酶辅助扩增（dRAA）技术与CRISPR-Cas12a系统相结合，建立了一种快速、准确、灵敏、直观的检测嗜水气单胞菌（A. hydrophila）的方法：dRAA-CRISPRCas12a，45 min内即可完成检测，且该方法使用了荧光-猝灭基团标记ssDNA报告探针，借助紫外手电筒即可观察结果，无需复杂的仪器，灵敏度与dPCR-CRISPR-Cas12a的结果一致[24]。

2.5 CRISPR-Cas12a在病原体检测中的更多应用

CRISPR-Cas12a在病原体检测中的更多应用如表1所示。

表1 CRISPR-Cas12a在病原体检测中的更多应用

虽然基于CRISPR-Cas12a系统的病原检测方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单和可与各种核酸扩增技术结合以满足不同条件下的需求等优点，但仍存在一些不足之处，例如：（1）CRISPR-Cas12a系统需要通过PAM序列来识别靶dsDNA，这样虽然增强了靶识别的特异性，但也限制了可选择的靶序列范围。（2）基于CRISPR-Cas12a系统的检测不易建立多重检测方法。多重检测方法的建立对系统中的Cas蛋白有严格要求，不同的Cas蛋白和报告基因可能会交叉切割，影响试验结果。（3）由于CRISPRCas12a系统的高灵敏度，很难量化高浓度的标靶，检测信号容易达到饱和，所以如何实现病原的现场快速定量检测，是未来值得深入研究的方向。（4）CRISPR-Cas12a用于检测时，通常使用两步法，即先进行核酸扩增再进行核酸检测，中间的操作可能会造成污染，影响试验结果。因此，在未来，应将研究重点放在优化核酸提取步骤、避免污染、实现多种病原的多重检测和定量检测等方面，使基于CRISPR-Cas12a系统的病原检测技术在复杂环境下的性能进一步提升。

3 小结

基于CRISPR-Cas12a系统的病原检测方法可达到阿摩尔级灵敏度，同时可区分核苷酸错配，且操作简单，适合现场检测。总体而言，基于该系统的病原检测方法为病原的分子检测提供了一种新的手段，目前已初见成效且发展迅速，是新一代核酸检测技术的重要发展方向。未来当人工智能等多种技术应用于CRISPR-Cas12a系统时，该系统将成为一种更有前景、应用更广泛的病原检测工具。