一株鸡源鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定

李富金，汪建华，高 凤，赵 远，陈 辉

（1.齐鲁动物保健品有限公司，山东 济南 250100；2.山东和康源生物育种股份有限公司，山东 济南）

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一种能够引起鸡、鸭、鹅等家禽、水禽及鸟类患流行性传染性浆膜炎的细菌，给养禽业带来严重的经济损失。浆膜炎以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及纤维素性输卵管炎为特征[1-2]。临床上关于鸭疫里默氏杆菌感染鸭、鹅的报道比较多，感染鸡的报道较少[3-8]，近几年笔者在临床发生传染病鼻炎、关节炎的病鸡中多次分离到该菌。2022年4月，河北沧州某肉种鸡场15周肉种鸡出现瘸腿、瘫痪病鸡，发病率10%，日淘汰率近0.15%，怀疑因呼肠孤病毒引起的病毒性关节炎，对病鸡进行实验室病原检测，结果在检测到呼肠孤病毒的同时也分离到一株细菌，经鉴别为鸭疫里默氏杆菌，因该菌在鸡上分离案例增多，现将鉴定结果汇报如下，供养殖从业者参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 来源河北沧州某肉种鸡场，无菌采集15周龄瘸腿瘫痪肉种鸡的肝、脑和关节。

1.1.2 实验动物 1日龄樱桃谷雏鸭，购自德州某孵化场。

1.1.3 实验试剂 营养琼脂培养基、麦康凯培养基、马丁肉汤培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，血清营养琼脂培养基由齐鲁动物保健品有限公司自制，病毒DNA/RNA纯化试剂盒购自杭州博日科技有限公司，2×Taq Master Mix、DNA Marker DL2000、GelRed核酸染料均购自诺唯赞生物科技有限公司，细菌微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 实验器材 核酸提取仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、生物安全柜、电子天平、CO2培养箱、显微镜等均由齐鲁动物保健有限公司研究院疫苗研究所自备。

1.1.5 药敏片 强力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩诺沙星、土霉素、粘杆菌素、头孢噻呋钠、头孢喹肟、泰地罗新、卡那霉素、林可大观霉素、加米霉素均由齐鲁动物保健有限公司研究院化药研究所惠赠。

1.1.6 PCR引物 根据GenBank发布的鸭疫里默氏杆菌（ATCC11845）标准菌株的全基因序列，设计16S rRNA特异性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息：（F: 5′-CA GCTTAACTGTAGAACTGC-3′；R: 5′-TCGAGAT TTGCATCACTTCG-3′）。

1.1.7 阳性血清 鸭疫里默氏杆菌1、2、4、5、6、7、10型阳性血清，由齐鲁动物保健有限公司研究院疫苗研究所自备。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养及纯化 无菌取病鸡肝、脑和关节，分别接种营养琼脂培养基、血清营养琼脂培养基、麦康凯培养基各2份，分别放普通培养箱及含5% CO2培养箱，37 ℃ 培养24～48 h，挑取血清琼脂培养基上长势良好的单个菌落进行纯培养。

1.2.2 染色镜检 挑取纯培养的菌株，按照常规方法涂片、固定，并用革兰染色液及瑞氏染液染色，镜检。

1.2.3 生化试验 在常规微量发酵管内滴加5%～10%牛血清，然后接种分离纯化菌株，37 ℃ 培养3 d。

1.2.4 PCR检测及测序 取纯培养的菌株菌液，利用核酸提取仪提取分离株DNA，以提取的DNA为反应模板，按照2×Taq Master Mix说明书，进行PCR反应。反应程序：95 ℃ 预变性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，共30个循环，72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保温。将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像仪观察电泳结果。选择条带清晰无杂带、目的条带位置正确的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.2.5 药敏试验 挑取纯培养的菌株均匀涂布在血清琼脂培养基平板上，将头孢噻呋钠、恩诺沙星等14种药物的药敏片紧贴于平皿表面，置于含5% CO2培养箱，37 ℃ 培养24 h，用游标卡尺测量每片药敏片周围抑菌圈直径，判断分离菌对各药敏片的敏感性。

1.2.6 动物回归试验 将分离菌株接种于含血清马丁肉汤培养基，37 ℃ 振荡培养24 h。活菌计数后，攻毒10只7日龄健康非免疫雏鸭，每只静脉注射5×107CFU活菌。接种后连续观察10 d，记录雏鸭临床表现，对病死鸭进行病理剖检观察，未死亡鸭处死后剖检观察，并无菌采集脑、肝脏分离细菌。

1.2.7 血清型鉴定 采用玻片凝集试验方法，按照文献方法进行，混合后反复震荡载玻片，注意观察，出现清晰的乳白色絮状凝集块者，判定为阳性，不出现凝集块则判定为阴性，阳性的重复为3次以防止假阳性[9-12]。

2 结果

2.1 细菌分离培养

分离菌在普通培养基和麦康凯培养基上不能生长，在含5% CO2条件下，在血清琼脂培养基上生长良好，如图1所示呈针尖大小、圆形、表面光滑、小露珠状半透明小菌落。

图1 分离菌在血清琼脂培养平板的菌落形态

2.2 染色镜检

染色后在显微镜下观察为革兰阴性短小杆菌，大小为0.3～0.5 µm，如图2所示菌体多单个存在，少数成对，偶尔呈链状排列，无芽孢，有荚膜，短杆状菌。

图2 分离菌革兰染色菌体形态

2.3 生化鉴定结果

分离的菌株不能发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露酵和山梨醇，靛基质、VP试验、硝酸盐还原试验、硫化氢产生、甲基红试验均为阴性，触酶、氧化酶试验为阳性，以上结果符合鸭疫里默氏杆菌的生化培养特性。

2.4 PCR鉴定及测序结果

（1）如图3所示，以分离的菌株DNA作为模板进行PCR扩增，结果显示，扩增产物片段（2号）与目的条带（1666 bp）大小相符。（2）对上述PCR扩增产物进行测序，登陆NCBI网站与已公布序列进行BLAST分析发现，该核苷酸序列与已知Riemerella anatipestifer 16S rRNA的部分序列同源性达到99.78%，确定分离到的菌株为鸭疫里默氏杆菌，命名为QLHB01。

图3 分离菌株16S rRNA基因扩增结果1. 阴性对照孔；2. 样品孔；M. Marker DL2000。

2.5 药敏试验结果

结果表明分离菌对头孢噻呋钠、头孢喹肟敏感，对强力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩诺沙星中介，而对土霉素、粘杆菌素、泰地罗新、卡那霉素、维可观（林可大观霉素）、加米霉素则不敏感。详细结果见下表1。

表1 分离菌株药敏试验结果

2.6 动物回归试验结果

雏鸭接种分离菌株12 h后，精神沉郁，食欲、饮欲下降，眼鼻分泌物增多，部分鸭出现典型的神经症状，表现为共济失调、头颈震颤等（图4、图5）。攻毒后雏鸭3 d开始出现死亡，剖检后可见心脏和肝脏表面覆有纤维素性渗出物（图6、图7），气囊上有干酪样物，脑膜血管树枝状充血。10 d后将未死亡鸭处死剖检，见心脏和肝脏表面的纤维素性渗出物增多，气囊混浊，脑膜出血。从脑组织中均分离到鸭疫里默氏杆菌，培养特性及镜检形态与分离菌株相同。

图4 对照鸭无异常

图5 攻毒鸭精神沉郁共济失调

图6 攻毒鸭死亡

图7 攻毒鸭剖检有典型浆膜炎病变

2.7 血清型鉴定

经玻片凝集试验，分离菌株可以与10型阳性血清产生凝集反应，与1、2、4、5、6、7型阳性血清不反应，被鉴定为10型。

3 讨论与结论

（1）本案例是从怀疑病毒性关节炎发病肉种鸡关节中分离到细菌，通过菌落观察、染色镜检、生化试验、分子生物学检测、药敏试验、血清型鉴定及动物回归试验的结果，判定分离菌为鸭疫里默氏杆菌，应该是呼肠孤病毒与鸭疫里默氏杆菌共感染。

（2）通过药敏试验发现分离菌对头孢噻呋钠及头孢喹肟较敏感，强力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩诺沙星也可以临床应用，鉴于主要病变在关节，养殖场选择用头孢噻呋钠（10 mg/kg体重）对出现症状的鸡进行注射，大群用强力霉素（15 mg/kg体重）配合氟苯尼考（15 mg/kg体重）饮水预防，追踪用药后的效果，部分鸡症状有缓解、恢复，但仍有部分瘫痪鸡进行了淘汰。本案例不是单纯细菌感染，药敏试验对选择敏感性药物来控制细菌感染是有帮助的，也能减少部分经济损失。

（3）血凝试验及动物回归试验结果显示，分离菌为10型鸭疫里默氏杆菌，且对雏鸭致病性较强。因与以前分离鸡源鸭疫里默氏杆菌发病日龄、感染器官及血清型（1型、2型）均不相同，且案例不多，因此未做SPF鸡的回归试验。

（4）鸭疫里默氏杆菌目前主要感染水禽，特别是15～35日龄的水禽，发病急，死亡快，死亡率高，给养殖场带来巨大经济损失，水禽养殖场非常重视该病的防控。在家禽上的案例不多，但有增多趋势，特别是水禽养殖密集区，感染鸡的几率增加，希望养殖场多关注该病的发展及流行情况。